Untersuchungen zur differenziellen Genexpression im ZNS von Noradrenalintransporter-Knockout- und Wildtyp-Mäusen

Die Wirkung aller klinisch relevanten Antidepressiva tritt erst nach mehreren Wochen auf. Diese Latenzzeit legt nahe, dass weniger die akuten pharmakologischen Effekte als vielmehr adaptive Veränderungen auf Rezeptorebene und anderen Ebenen den antidepressiven Effekt auslösen. Der Wirkmechanismus einer Vielzahl von antidepressiv wirksamen Verbindungen ist die Hemmung des Noradrenalintransporters, der physiologisch für die schnelle Rückaufnahme von Noradrenalin aus dem synaptischen Spalt noradrenerger Neurone verantwortlich ist. Diese Antidepressiva erhöhen die Noradrenalin-Konzentration im synaptischen Spalt. Mäuse, bei denen der Noradrenalintransporter durch homologe Rekombination inaktiviert (Knockout) wurde (NAT-/--Mäuse), können als Modell für mit Antidepressiva behandelte Tiere angesehen werden. Diese NAT-/--Mäuse verhalten sich in relevanten Verhaltenstests wie mit Antidepressiva behandelte Wildtyp-Tiere (NAT+/+). Die Untersuchung der durch die Inaktivierung des Noradrenalintransporters induzierten adaptiven Veränderung der Genexpression im ZNS der Tiere kann zum Verständnis des antidepressiven Wirkmechanismus beitragen. Der Einfluss des Knockouts des Noradrenalintransporters auf die Gewebekonzentrationen von Noradrenalin und Dopamin sowie ihrer Metaboliten MHPG und DOPAC wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit mittels HPLC in den Hirnregionen Bulbus olfactorius, Cerebellum, Cortex, Hirnstamm, Hippocampus, Hypothalamus und Striatum bestimmt. Die so ermittelten Noradrenalin-Gewebespiegel zeigten, außer im Striatum, einen Verlust der intraneuronalen Noradrenalin-Speicherung von 30-85 % in den NAT-/--Tieren. Die Gewebespiegel des Noradrenalinmetaboliten MHPG wiesen nur im Cerebellum der NAT-/--Tiere einen im Vergleich zu NAT+/+-Tieren um 20 % erniedrigten Wert auf. Ferner war die Konzentration an Dopamin ausschließlich im Bulbus olfactorius der NAT-/--Tiere signifikant erniedrigt. Keinen Einfluss hatte die Inaktivierung des Noradrenalintransporters auf die Konzentration des Dopaminmetaboliten DOPAC in den betrachteten Hirnregionen. Das Hauptziel dieser Arbeit war die Untersuchung der differenziellen Genexpression im ZNS von NAT-/-- und NAT+/+-Mäusen. Hierzu wurde eine umfassende Genexpressionsanalyse mit der Microarray-Technologie an Gesamthirnen von NAT-/-- und NAT+/+-Tieren vorgenommen. Von den mehr als 8000 quantifizierten Genen wurden 90 Gene maßgeblich in ihrer mRNA-Expression durch den Knockout des Noradrenalintransporters induziert und lediglich 4 supprimiert. Unter den Genen mit erhöhter Expression befinden sich vornehmlich solche, die den ribosomalen Proteinen (30 %) oder den Proteinen der Atmungskette (27 %) zuzuordnen sind. Die erhöhte Expression der ribosomalen Proteine korreliert gut mit den aus der qPCR erhaltenen Ergebnissen für die ribosomale 18s-rRNA, welche im Bulbus olfactorius, Hippocampus und Striatum durch den Knockout induziert wurde. Die erhöhte Expression der für Enzyme der Atmungskette kodierenden mRNAs ist ein Hinweis auf einen erhöhten allgemeinen Grundumsatz in diesen Tieren, der ursächlich an dem im Vergleich zu NAT+/+-Tieren erniedrigten Körpergewichten beteiligt sein könnte. Zusätzlich zu der umfassenden Analyse der Genexpression auf Gesamthirnebene wurde die Genexpression von fünfzehn selektierten Zielgenen der definierten Hirnregionen Bulbus olfactorius, Cerebellum, Cortex, Hirnstamm, Hippocampus, Hypothalamus und Striatum sowie im Gesamthirn von NAT-/-- und NAT+/+-Tieren mit quantitativer real-time PCR (qPCR) untersucht. Auf Gesamthirnebene wurde weder die mRNA-Expression der Noradrenalin-Syntheseenzyme (Dopamin-ß-Hydroxylase und Tyrosinhydroxylase), der Neurotransmittertransporter (Dopamintransporter und vesikulärer Monoamintransporter 2), der adrenergen Rezeptoren (α1A, α1B, α1D, α2A, α2B, α2C, ß1 und ß2), noch der Dopaminrezeptoren (D1, D2 und D3) durch die Inaktivierung des Noradrenalintransporters signifikant beeinflusst. Die Untersuchungen an den genannten Hirnregionen zeigten nur für die mRNA-Expression des α1B-, α2A und α2C-Adrenozeptors einen regional begrenzten Einfluss an. So war die mRNA-Expression dieser drei Rezeptoren im Hirnstamm der NAT-/--Tiere um den Faktor 4 höher als in den NAT+/+-Tieren. Außerdem war die Expression des α2C-Adrenozeptors im Striatum und Cerebellum der NAT-/--Tiere 2-fach erhöht. In quantitativen Autoradiografien mit dem tritiierten Radioliganden [³H]RX821002 wurde nachgewiesen, dass die erhöhte mRNA-Expression der α2A- und α2C-Adrenozeptoren auch zu einer erhöhten Expression der Rezeptorproteine in allen untersuchten Hirnregionen der NAT-/--Tiere führte. Die ausgeprägteste Expressionserhöhung (+15-26 %) wurde in den Regionen Cortex, Striatum, Hippocampus, erweiterte Amygdala, Locus coeruleus und lateraler parabrachialer Nukleus bestimmt. Die funktionelle Konsequenz der erhöhten Expression der α2-Adrenozeptoren im ZNS der NAT-/--Tiere zeigte sich auch in einem Verhaltenstest. In diesem Test war die vom α2-Agonisten Clonidin vermittelte Hypoaktivität in den NAT-/--Tieren signifikant ausgeprägter als in den NAT+/+-Tieren. Somit weisen die NAT-/--Tiere im Vergleich zu den NAT+/+-Tieren eine erhöhte mRNA- und Proteinexpression, sowie eine erhöhte Funktion der zentralen α2-Rezeptoren auf

Interleukin-4 Protects Dopaminergic Neurons In vitro but Is Dispensable for MPTP-Induced Neurodegeneration In vivo

Microglia are involved in physiological as well as neuropathological processes in the central nervous system (CNS). Their functional states are often referred to as M1-like and M2-like activation, and are believed to contribute to neuroinflammation-mediated neurodegeneration or neuroprotection, respectively. Parkinson’s disease (PD) is one the most common neurodegenerative disease and is characterized by the progressive loss of midbrain dopaminergic (mDA) neurons in the substantia nigra resulting in bradykinesia, tremor, and rigidity. Interleukin 4 (IL4)-mediated M2-like activation of microglia, which is characterized by upregulation of alternative markers Arginase 1 (Arg1) and Chitinase 3 like 3 (Ym1) has been well studied in vitro but the role of endogenous IL4 during CNS pathologies in vivo is not well understood. Interestingly, microglia activation by IL4 has been described to promote neuroprotective and neurorestorative effects, which might be important to slow the progression of neurodegenerative diseases. In the present study, we addressed the role of endogenous and exogenous IL4 during MPP+-induced degeneration of mDA neurons in vitro and further addressed the impact of IL4-deficiency on neurodegeneration in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) mouse model of PD in vivo. Our results clearly demonstrate that exogenous IL4 is important to protect mDA neurons in vitro, but endogenous IL4 seems to be dispensable for development and maintenance of the nigrostriatal system as well as MPTP-induced loss of TH+ neurons in vivo. These results underline the importance of IL4 in promoting a neuroprotective microglia activation state and strengthen the therapeutic potential of exogenous IL4 for protection of mDA neurons in PD models

Congenital heart disease risk loci identified by genome-wide association study in European patients

Genetic factors undoubtedly affect the development of congenital heart disease (CHD) but still remain ill defined. We sought to identify genetic risk factors associated with CHD and to accomplish a functional analysis of SNP-carrying genes. We performed a genome-wide association study (GWAS) of 4034 White patients with CHD and 8486 healthy controls. One SNP on chromosome 5q22.2 reached genome-wide significance across all CHD phenotypes and was also indicative for septal defects. One region on chromosome 20p12.1 pointing to the MACROD2 locus identified 4 highly significant SNPs in patients with transposition of the great arteries (TGA). Three highly significant risk variants on chromosome 17q21.32 within the GOSR2 locus were detected in patients with anomalies of thoracic arteries and veins (ATAV). Genetic variants associated with ATAV are suggested to influence the expression of WNT3, and the variant rs870142 related to septal defects is proposed to influence the expression of MSX7. We analyzed the expression of all 4 genes during cardiac differentiation of human and murine induced pluripotent stem cells in vitro and by single-cell RNA-Seq analyses of developing murine and human hearts. Our data show that MACROD2, GOSR2, WNT3, and MSX7 play an essential functional role in heart development at the embryonic and newborn stages

Increased Expression of the Auxiliary β(2)-subunit of Ventricular L-type Ca(2+) Channels Leads to Single-Channel Activity Characteristic of Heart Failure

BACKGROUND: Increased activity of single ventricular L-type Ca(2+)-channels (L-VDCC) is a hallmark in human heart failure. Recent findings suggest differential modulation by several auxiliary β-subunits as a possible explanation. METHODS AND RESULTS: By molecular and functional analyses of human and murine ventricles, we find that enhanced L-VDCC activity is accompanied by altered expression pattern of auxiliary L-VDCC β-subunit gene products. In HEK293-cells we show differential modulation of single L-VDCC activity by coexpression of several human cardiac β-subunits: Unlike β(1) or β(3) isoforms, β(2a) and β(2b) induce a high-activity channel behavior typical of failing myocytes. In accordance, β(2)-subunit mRNA and protein are up-regulated in failing human myocardium. In a model of heart failure we find that mice overexpressing the human cardiac Ca(V)1.2 also reveal increased single-channel activity and sarcolemmal β(2) expression when entering into the maladaptive stage of heart failure. Interestingly, these animals, when still young and non-failing (“Adaptive Phase”), reveal the opposite phenotype, viz : reduced single-channel activity accompanied by lowered β(2) expression. Additional evidence for the cause-effect relationship between β(2)-subunit expression and single L-VDCC activity is provided by newly engineered, double-transgenic mice bearing both constitutive Ca(V)1.2 and inducible β(2) cardiac overexpression. Here in non-failing hearts induction of β(2)-subunit overexpression mimicked the increase of single L-VDCC activity observed in murine and human chronic heart failure. CONCLUSIONS: Our study presents evidence of the pathobiochemical relevance of β(2)-subunits for the electrophysiological phenotype of cardiac L-VDCC and thus provides an explanation for the single L-VDCC gating observed in human and murine heart failure

A hierarchical regulatory network analysis of the vitamin D induced transcriptome reveals novel regulators and complete VDR dependency in monocytes

The transcription factor vitamin D receptor (VDR) is the high affinity nuclear target of the biologically active form of vitamin D3 (1,25(OH)2D3). In order to identify pure genomic transcriptional effects of 1,25(OH)2D3, we used VDR cistrome, transcriptome and open chromatin data, obtained from the human monocytic cell line THP-1, for a novel hierarchical analysis applying three bioinformatics approaches. We predicted 75.6% of all early 1,25(OH)2D3-responding (2.5 or 4 h) and 57.4% of the late differentially expressed genes (24 h) to be primary VDR target genes. VDR knockout led to a complete loss of 1,25(OH)2D3–induced genome-wide gene regulation. Thus, there was no indication of any VDR-independent non-genomic actions of 1,25(OH)2D3 modulating its transcriptional response. Among the predicted primary VDR target genes, 47 were coding for transcription factors and thus may mediate secondary 1,25(OH)2D3 responses. CEBPA and ETS1 ChIP-seq data and RNA-seq following CEBPA knockdown were used to validate the predicted regulation of secondary vitamin D target genes by both transcription factors. In conclusion, a directional network containing 47 partly novel primary VDR target transcription factors describes secondary responses in a highly complex vitamin D signaling cascade. The central transcription factor VDR is indispensable for all transcriptome-wide effects of the nuclear hormone

Galaxy HiCExplorer 3: a web server for reproducible Hi-C, capture Hi-C and single-cell Hi-C data analysis, quality control and visualization

International audienceThe Galaxy HiCExplorer provides a web service at https://hicexplorer.usegalaxy.eu. It enables the integrative analysis of chromosome conformation by providing tools and computational resources to pre-process, analyse and visualize Hi-C, Capture Hi-C (cHi-C) and single-cell Hi-C (scHi-C) data. Since the last publication, Galaxy HiCExplorer has been expanded considerably with new tools to facilitate the analysis of cHi-C and to provide an in-depth analysis of Hi-C data. Moreover, it supports the analysis of scHi-C data by offering a broad range of tools. With the help of the standard graphical user interface of Galaxy, presented workflows, extensive documentation and tutorials, novices as well as Hi-C experts are supported in their Hi-C data analysis with Galaxy HiCExplorer