In vitro culture of ovine mammary gland cells expressing beta-lactoglobulin and beta-casein

The expression of milk proteins in vitro is essential to exploit the mammary gland cells as a biological model. Enzymatic tissue disaggregation has been widely used to establish mammary cell culture, but its effect in long-term ovine mammary cell culture is not completely elucidated. This study aimed at comparing mechanical/enzymatic and mechanical dissociation methods to establish ovine mammary cell culture. We compared cellular differentiation induced by lactating ewe sérum or fetal bovine serum based on the gene expression levels of milk proteins (beta-lactoglobulin, alpha s1-casein, and betacasein). Mechanically dissociated cells were positive immunostaining for cytokeratin 8.13, such as mammary epithelial cells. These cells are responsible for milk protein expression and they are low immunostaining for vimentin, mesenchymal marker. Mechanical/enzymatic dissociation cells were positive for vimentin. The fastest cell growth (cell/hour) was observed in the mechanical dissociation group cultured with 10% fetal bovine serum medium. Mechanically and mechanically/enzymatically derived cells were able to express beta-casein and beta-lactoglobulin, but not alpha s1-casein. The relative expression of beta-lactoglobulin was not affected by the tissue dissociation method or culture media, beta-casein relative expression was down regulated in mechanically dissociated cells cultured in the presence of lactating ewe serum, (P = 0.019). Beta-casein relative expression was also down regulated in mechanically/enzymatically dissociated cells cultured with fetal bovine sérum (P = 0.021). In the present conditions, we conclude that mechanical dissociation followed by culture with 10% of fetal bovine serum was the most efficient method to induce milk proteins’ mRNA expression by ovine mammary epithelial cells in vitro.A expressão in vitro de proteínas do leite e essencial para explorar as células da glândula mamaria como um modelo biológico. A desagregação tecidual via enzimática e amplamente utilizada para o estabelecimento cultivo de células mamarias. No entanto, seu efeito a longo prazo no cultivo de células da glândula mamaria ovina ainda não e bem elucidado. Este estudo tem como objetivo comparar dois métodos de dissociação tecidual, mecânico/enzimático e mecânico, para estabelecer cultivo celular de glândula mamaria ovina. A indução da diferenciação celular, por adição de soro de ovelha lactante ou soro fetal bovino, foi avaliada pelos níveis de expressão de proteínas do leite (beta-lactoglobulina, alpha s1-caseina e beta-caseína). Células mecanicamente dissociadas foram positivamente marcadas para a presença de citoqueratina 8.13, marcador para células epiteliais mamarias. Essas células são as responsáveis pela produção das proteínas do leite e são pouco marcadas para a presença de vimentina, marcador para células de origem mesenquimal. Já as células obtidas da dissociação mecânica/ enzimática foram positivamente marcadas para presença de vimentina. A maior velocidade de crescimento (células/hora) foi observado para o grupo com dissociação mecânica cultivado em meio com 10% de soro fetal bovino. As células obtidas tanto da dissociação mecânica quanto mecânica/enzimática foram capazes de expressar beta-lactoglobulina e beta-caseína, mas não alfa s1-caseina. A expressão relativa de beta-lactoglobulina não foi afetada pelo método de dissociação ou meio de cultivo. A expressão relativa da beta-caseína foi negativamente regulada para células mecanicamente dissociadas e cultivadas na presença de soro de ovelha lactante (P = 0,019). A expressão relativa da beta-caseína também foi negativamente regulada para células dissociadas de forma mecânica/enzimática e cultivadas com soro fetal bovino (P = 0,021). Nas condições do presente estudo, concluímos que o método de dissociação mecânica seguido pelo cultivo em meio com 10% de soro fetal bovino foi o método mais eficiente para induzir a expressão mRNA de proteínas do leite por células epiteliais mamarias ovinas in vitro

The scientific structure of competitive intelligence

A estrutura científica de uma área é a base para o seu reconhecimento como disciplina científica. Sendo a Inteligência Competitiva uma área recente do conhecimento, objetiva-se com esta pesquisa a proposição de sua estrutura científica e sistema de investigação nos níveis epistemológico, científico e aplicado. Busca-se também identificar o paradigma da Inteligência Competitiva, enumerar as teorias e modelos que a fundamentam e listar as soluções de problemas da vida real propostos por essa área. Trata-se de pesquisa descritiva cujo método utilizado foi o levantamento e análise estatística do comportamento de variáveis de um modelo sistêmico de definição de objeto científico em uma amostra formada por artigos científicos publicados em língua inglesa e portuguesa. Os resultados mostram a existência de estudo nos três níveis da estrutura científica. Há três paradigmas que regem a pesquisa nessa área. Apresenta corpo teórico que apoia estudos desse campo e que é utilizado para auxiliar na solução de problemas de ordem prática. Há pesquisas em nível aplicado, destacando-se as relacionadas à melhoria do processo de Inteligência Competitiva e à contribuição desta área a outros processos organizacionais. Conclui-se que a proposta explicitada de estrutura científica e de sistema de investigação, nos níveis epistemológico, científico e aplicado, para a Inteligência Competitiva é adequada à compreensão desta disciplina.The scientific framework of a new field of knowledge is the foundation for its recognition as a scientific discipline. Considering that competitive intelligence is a recent field of knowledge, the main purpose of this study is to propose a scientific framework for competitive intelligence and a hierarchical research system with practical, scientific and epistemological perspectives levels. Other purposes include identifying the paradigm of competitive intelligence, enumerating its theories and models, and listing the solutions for real world problems proposed by this field. This is a descriptive research that uses the survey method and statistical analysis of variable behavior from a systemic model for defining scientific objects, using a sample of scientific articles published both in English and Portuguese. The results showed the existence of three scientific levels of research in this field. The following three paradigms support research in this field: a theoretical framework that supports studies in the field that are used to help solving practical problems; applied studies, particularly those related to improving the process of competitive intelligence; and those that contribute to other organizational processes. It may be concluded that the explicit scientific framework and a hierarchical research system proposed in the epistemological, scientific and practical levels are suitable for understanding this discipline

Expression of molecular markers in spermatogonia

Em mamíferos, a espermatogênese é mantida pela autorrenovação e diferenciação das células-tronco espermatogoniais (SSC). Apesar da grande importância do SSC para a fertilidade masculina, em Bos taurus pouco se sabe sobre a sua identificação e biologia celular. Para roedores, mais de 30 marcadores para células germinativas indiferenciadas já foram descritos. No entanto, ainda não é conhecido um marcador específico apenas para SSC. Quase todos são também expressos por gonócitos, espermatogônias mais diferenciadas ou mesmo células somáticas. Yin Yang 2 (YY2) é um factor de transcrição expresso nas células com a morfologia de gonócitos e SSC, sendo um candidato a marcador de SSC. Assim, a identificação de novos marcadores para SSC e factores que afectam a sua expressão, tais como a idade, são fundamentais para o desenvolvimento da biotecnologia como transgenia e tratamento de infertilidade, nos quais as SSC poderiam ser ferramentas biológicos importantes. Assim, nesta tese temos duas hipóteses principais: 1) a idade do dador afeta a expressão de marcadores moleculares específicos de SSC bovinas assim como potencial de células-tronco dessas células e que as sequências de DNA em que se associa YY2 regulam a expressão génica de SSC em camundongos. Os objetivos específicos, organizados em 4 artigos científicos, foram: identificar a melhor plaqueamento diferencial para enriquecer SSC bovina (artigo 1), verificar se a expressão de marcadores moleculares de SSC bovina difere entre adultos pré-púberes (artigo 2 e 3), identificar novos marcadores específicos para SSC em Bos taurus (artigo 3), verificar que a idade afeta o potencial de célula-tronco de SSC bovinas (artigo 3), descrever YY2 como um marcador específico para SSC em camundongos e verificar se as sequências DNA associadas YY2 são loci de importância para SSC. Assim, definimos o melhor plaqueamento diferencial para o enriquecimento de SSC bovinas, que idade afeta a expressão marcadores já estabelecidos assim como genes específicos do transcriptoma de SSC bovinas e que idade também afeta o seu potencial de células-tronco (ensaio de repopulação). Concluímos também que YY2 é um marcador para SSC de camundongo em cultivo, em animais adultos e que as sequências do genoma que se associam YY2 possivelmente tem capacidade de regulação génica em SSC murina.Mammalian spermatogenesis is sustained by self-renewal and differentiation of spermatogonial stem cells (SSC). Despite the importance of the SSC for male fertility, in Bos taurus líttle is known about their identification identity and cell biology. For rodents, more than thirty markers for undifferentiated germ cells have already been described. However, none of these represents a marker specific for SSC, as most are also expressed in gonocytes, differentiated spermatogonia or even somatic cells. Yin Yang 2 (YY2) is a transcription factor specifically expressed in cells with the morphology of gonocytes and SSC in the mouse, being a candidate marker for SSC. For the use of SSC as an important biological tool in the development of biotechnology such as transgenesis and the treatment of infertility, it is important to identify new markers for SSC and factors that affect their expression, such as the age of donors. Therefore, the experimental work described in this thesis was based on two main hypothesis: (1) the donor age affects the expression of specific molecular markers in SSC as well their potential as stem cells and 2) YY2 exerts important functions in SSC and genomic targets correspond to loci relevant for gene regulation or genome management in SSC. The specific goals have been organized in 4 manuscripts as follows: optimization of differential plating to enrich for bovine SSC (Article 1), check if the expression of molecular markers of bovine SSCs differs between prepubertal and adult donors (Article 2 and 3), identify new markers specific for SSC in Bos taurus (Article 3), continuation of the initial description of YY2 as a specific marker for SSC in mice and check if sequences bound by YY2 in vivo harbor the capacity to influence gene expression in SSC. As conclusions, we present an optimized differential plating protocol for the enrichment of bovine SSC, we conclude that age effects the expression of SSC markers, the expression of specific genes of bovine SSC and that age also affects their potential as stem cells (measured in repopulation assays). We also contribute to the description of the restricted expression of YY2 in prepuberal and adult SSC in mice and we show that YY2 binding sites represent genomic sequences relevant for control of gene expression

Models for the production of human recombinant erythropoietin in vivo and in vitro with plasmidial vectors in ovine

Para produção de biofármacos protéicos, como a eritropoietina recombinante humana (EPOrh), são necessárias alterações pós-traducionais adequadas que garantam a sua especificidade e atividade biológica. Essas características são obtidas apenas em biorretores baseados em células eucarióticas, como as da glândula mamária. Sistemas baseados nesse tipo celular, tanto in vivo quanto in vitro, já são utilizados para produção estratégica e viável de proteínas recombinantes biologicamente ativas. Assim, tanto o estabelecimento de novas linhagens de células mamárias que apresentem boa expressão protéica quanto o desenvolvimento de sistemas in vivo que utilizem a estrutura da glândula mamária para essa produção de proteínas recombinantes são de grande valia. O presente trabalho teve como objetivo comparar dois métodos de estabelecimento de uma cultura de células de glândula mamárias ovinas, enzimático e não enzimático, e verificar sua capacidade de expressão das proteínas do leite β-lactoglobulina, α-caseína, β-caseína e κ-caseína mediante o tratamento com SFB (soro fetal bovino) ou SOL (soro de ovelha lactante), na presença ou não de Matrigel. Para isso, foi realizado um experimento in vitro, no qual foi estabelecido o cultivo celular até a passagem 12 (P12) de duas linhagens celulares: digerida (LD) e não digerida (LND). Para a LD na P12 foi observado apenas um tipo celular, o qual era positivo para a marcação com vimentina. Essa linhagem apresentou expressão gênica de β-caseína e β-lactoglobulina apenas quando tratada com meio de cultivo acrescido de SFB, sendo a expressão inferior (P=0,001) ao grupo da LND submetido ao mesmo tratamento. Já a LND, quando tratada com meio adicionado com SFB expressou κ-caseína além da β-caseína e β-lactoglobulina. A troca do SFB do meio de cultivo por SOL aumentou a expressão gênica de β-lactoglobulina (P=0,001) para ambas linhagens. Foi realizada a curva de crescimento para LD e LND na P12 com o meio de cultivo acrescido com SFB ou SOL. Para a LND observou-se o efeito do meio na velocidade de crescimento celular, sendo que foi maior para o grupo tratado com SFB (P<0,05). Para a LD, não ocorreu o efeito do meio na velocidade de crescimento celular (P>0,05), não sendo observada diferença com a LND tratada com SOL (P>0,05). A LND apresentou marcação positiva para a presença de vimentina e citoqueratina. Este trabalho visou, ainda, estabelecer um sistema de produção da EPOrh no leite de ovelhas não transgênicas pela técnica de infusão intra-mamária in vivo de dois plasmídeos diferentes e verificar a secreção qualitativa desta proteína por Western-blotting. Assim, foi feito um experimento in vivo no qual glândulas mamárias de ovelhas foram transfectadas com dois plasmídeos diferentes: ALAC (n=2), BGL (n=2) e controle negativo (n=2). Após a infusão dos plasmídeos, foi realizada a eletroporação de cada teto (3 choques de 500 volts com a duração de 15ms cada, sendo realizada a inversão da polaridade). Os animais foram ordenhados durante 20 dias após a transfecção, porém não foi possível detectar a presença de EPOrh nas amostras de leite analisadas. O limiar de detecção do teste utilizado foi de 67,5pg de EPOrh (Eritromax®) em leite controle negativo de ovelha. Concluindo, foi possível estabelecer o cultivo in vitro das LD e LND com capacidade de expressar proteínas do leite, sendo a expressão da β-lactoglobulina aumentada pelo tratamento com SOL. Ambas as linhagens apresentaram marcação positiva para vimentina, mas apenas LND para citoqueratina. Ainda, para o experimento in vivo, não foi possível detectar a expressão de EPOrh no leite das ovelhas transfectadas com os plasmídeos ALAC e BGL.Some post-translational modifications are necessary for the production of biopharmaceutical proteins, such as recombinant human erythropoietin (rhEPO), with a good specific action and a high biological activity. These modifications are obtained only by bioreactors based on eukaryotic cell as mammary cells. Bioreactors, in vivo or in vitro, with this kind of cell have been used for a viable and strategic production of biologically active recombinant proteins. For this reason, the establishment of a new line of mammary cells with high milk protein expression and the development of systems for production of recombinant proteins by the mammary gland in vivo are essential studies. One of the main objectives of this study was to compare two methods, enzymatic and non-enzymatic, to establish ovine mammary cells culture and verify their gene expression of milk proteins such as β-lactoglobulin, α-casein, β-casein and κ-casein with different treatments: LOS (lactating ovine serum) or FBS (fetal bovine serum) added to the culture medium, in the presence or absence of Matrigel®. In this manner, an in vitro study was performed and the culture of two lines were established, digested (DL) and non-digested (NDL), of ovine mammary cell until the passage 12 (P12). In DL was observed just one cellular type that was positive for staining with vimentin. This cell line expressed β-lactoglobulin and β-casein genes with the FBS treatment and without Matrigel. The gene expression was lower (P=0,001) when compared to the NDL under the same conditions of culture. Then, the NDL expressed β-lactoglobulin, β-casein and κ-casein genes when treated with FBS without Matrigel. The treatment with LOS in the culture medium increased the gene expression of β-lactoglobulin for both cell lines. The growth curve was determined with both cell lines in P12 with FBS or LOS treatment. For the NDL, the type of medium had effect on the cell growth speed and was highest with the FBS treatment (P<0,05). However, the medium did not have effect on growth speed of LD (P>0,05) and no difference was observed at the NDL treated with LOS (P>0,05). The NDL was positive for staining with vimentin and cytokeratin. The second main objective of this study was to establish an in vivo system for the production of rhEPO in milk of non-transgenic ewes by the intra-mammary infusion of two different plasmids and verify the qualitative milk secretion of this protein by western-blotting. In this way, in the in vivo experiment ovine mammary glands were transfected with two different plasmids: ALAC (n=2), BGL (n=2) and negative control (n=2). Each half udder was filled with plasmid solution and three 3 electric pulses of 500 volts were applied for 15ms each, followed by another three pulses with reversed polarity. The three animals were milked for 20 days after transfection, nevertheless it was not possible to identify rhEPO in any milk sample. The test threshold to identify rhEPO (Eritromax®) in milk from a negative control animal was 67,5pg. In conclusion, the in vitro culture of NDL and DL was established up to the P12 with expression of milk protein and the LOS treatment increased the expression of β-lactoglobulin. The two cell lines culture were positive for staining of vimentina but only NDL was positive for cytokeratin. In the in vivo experiment, rhEPO secretion was not detected in the milk from ewes transfected with ALAC and BGL plasmids

Models for the production of human recombinant erythropoietin in vivo and in vitro with plasmidial vectors in ovine

Para produção de biofármacos protéicos, como a eritropoietina recombinante humana (EPOrh), são necessárias alterações pós-traducionais adequadas que garantam a sua especificidade e atividade biológica. Essas características são obtidas apenas em biorretores baseados em células eucarióticas, como as da glândula mamária. Sistemas baseados nesse tipo celular, tanto in vivo quanto in vitro, já são utilizados para produção estratégica e viável de proteínas recombinantes biologicamente ativas. Assim, tanto o estabelecimento de novas linhagens de células mamárias que apresentem boa expressão protéica quanto o desenvolvimento de sistemas in vivo que utilizem a estrutura da glândula mamária para essa produção de proteínas recombinantes são de grande valia. O presente trabalho teve como objetivo comparar dois métodos de estabelecimento de uma cultura de células de glândula mamárias ovinas, enzimático e não enzimático, e verificar sua capacidade de expressão das proteínas do leite β-lactoglobulina, α-caseína, β-caseína e κ-caseína mediante o tratamento com SFB (soro fetal bovino) ou SOL (soro de ovelha lactante), na presença ou não de Matrigel. Para isso, foi realizado um experimento in vitro, no qual foi estabelecido o cultivo celular até a passagem 12 (P12) de duas linhagens celulares: digerida (LD) e não digerida (LND). Para a LD na P12 foi observado apenas um tipo celular, o qual era positivo para a marcação com vimentina. Essa linhagem apresentou expressão gênica de β-caseína e β-lactoglobulina apenas quando tratada com meio de cultivo acrescido de SFB, sendo a expressão inferior (P=0,001) ao grupo da LND submetido ao mesmo tratamento. Já a LND, quando tratada com meio adicionado com SFB expressou κ-caseína além da β-caseína e β-lactoglobulina. A troca do SFB do meio de cultivo por SOL aumentou a expressão gênica de β-lactoglobulina (P=0,001) para ambas linhagens. Foi realizada a curva de crescimento para LD e LND na P12 com o meio de cultivo acrescido com SFB ou SOL. Para a LND observou-se o efeito do meio na velocidade de crescimento celular, sendo que foi maior para o grupo tratado com SFB (P<0,05). Para a LD, não ocorreu o efeito do meio na velocidade de crescimento celular (P>0,05), não sendo observada diferença com a LND tratada com SOL (P>0,05). A LND apresentou marcação positiva para a presença de vimentina e citoqueratina. Este trabalho visou, ainda, estabelecer um sistema de produção da EPOrh no leite de ovelhas não transgênicas pela técnica de infusão intra-mamária in vivo de dois plasmídeos diferentes e verificar a secreção qualitativa desta proteína por Western-blotting. Assim, foi feito um experimento in vivo no qual glândulas mamárias de ovelhas foram transfectadas com dois plasmídeos diferentes: ALAC (n=2), BGL (n=2) e controle negativo (n=2). Após a infusão dos plasmídeos, foi realizada a eletroporação de cada teto (3 choques de 500 volts com a duração de 15ms cada, sendo realizada a inversão da polaridade). Os animais foram ordenhados durante 20 dias após a transfecção, porém não foi possível detectar a presença de EPOrh nas amostras de leite analisadas. O limiar de detecção do teste utilizado foi de 67,5pg de EPOrh (Eritromax®) em leite controle negativo de ovelha. Concluindo, foi possível estabelecer o cultivo in vitro das LD e LND com capacidade de expressar proteínas do leite, sendo a expressão da β-lactoglobulina aumentada pelo tratamento com SOL. Ambas as linhagens apresentaram marcação positiva para vimentina, mas apenas LND para citoqueratina. Ainda, para o experimento in vivo, não foi possível detectar a expressão de EPOrh no leite das ovelhas transfectadas com os plasmídeos ALAC e BGL.Some post-translational modifications are necessary for the production of biopharmaceutical proteins, such as recombinant human erythropoietin (rhEPO), with a good specific action and a high biological activity. These modifications are obtained only by bioreactors based on eukaryotic cell as mammary cells. Bioreactors, in vivo or in vitro, with this kind of cell have been used for a viable and strategic production of biologically active recombinant proteins. For this reason, the establishment of a new line of mammary cells with high milk protein expression and the development of systems for production of recombinant proteins by the mammary gland in vivo are essential studies. One of the main objectives of this study was to compare two methods, enzymatic and non-enzymatic, to establish ovine mammary cells culture and verify their gene expression of milk proteins such as β-lactoglobulin, α-casein, β-casein and κ-casein with different treatments: LOS (lactating ovine serum) or FBS (fetal bovine serum) added to the culture medium, in the presence or absence of Matrigel®. In this manner, an in vitro study was performed and the culture of two lines were established, digested (DL) and non-digested (NDL), of ovine mammary cell until the passage 12 (P12). In DL was observed just one cellular type that was positive for staining with vimentin. This cell line expressed β-lactoglobulin and β-casein genes with the FBS treatment and without Matrigel. The gene expression was lower (P=0,001) when compared to the NDL under the same conditions of culture. Then, the NDL expressed β-lactoglobulin, β-casein and κ-casein genes when treated with FBS without Matrigel. The treatment with LOS in the culture medium increased the gene expression of β-lactoglobulin for both cell lines. The growth curve was determined with both cell lines in P12 with FBS or LOS treatment. For the NDL, the type of medium had effect on the cell growth speed and was highest with the FBS treatment (P<0,05). However, the medium did not have effect on growth speed of LD (P>0,05) and no difference was observed at the NDL treated with LOS (P>0,05). The NDL was positive for staining with vimentin and cytokeratin. The second main objective of this study was to establish an in vivo system for the production of rhEPO in milk of non-transgenic ewes by the intra-mammary infusion of two different plasmids and verify the qualitative milk secretion of this protein by western-blotting. In this way, in the in vivo experiment ovine mammary glands were transfected with two different plasmids: ALAC (n=2), BGL (n=2) and negative control (n=2). Each half udder was filled with plasmid solution and three 3 electric pulses of 500 volts were applied for 15ms each, followed by another three pulses with reversed polarity. The three animals were milked for 20 days after transfection, nevertheless it was not possible to identify rhEPO in any milk sample. The test threshold to identify rhEPO (Eritromax®) in milk from a negative control animal was 67,5pg. In conclusion, the in vitro culture of NDL and DL was established up to the P12 with expression of milk protein and the LOS treatment increased the expression of β-lactoglobulin. The two cell lines culture were positive for staining of vimentina but only NDL was positive for cytokeratin. In the in vivo experiment, rhEPO secretion was not detected in the milk from ewes transfected with ALAC and BGL plasmids