Spodoptera littoralis-induced lectin expression in tobacco

The induced defense response in plants towards herbivores is mainly regulated by jasmonates and leads to the accumulation of so-called jasmonate-induced proteins. Recently, a jasmonate (JA) inducible lectin called Nicotiana tabacum agglutinin or NICTABA was discovered in tobacco (N. tabacum cv Samsun) leaves. Tobacco plants also accumulate the lectin after insect attack by caterpillars. To study the functional role of NICTABA, the accumulation of the JA precursor 12-oxophytodienoic acid (OPDA), JA as well as different JA metabolites were analyzed in tobacco leaves after herbivory by larvae of the cotton leafworm (Spodoptera littoralis) and correlated with NICTABA accumulation. It was shown that OPDA, JA as well as its methyl ester can trigger NICTABA accumulation. However, hydroxylation of JA and its subsequent sulfation and glucosylation results in inactive compounds that have lost the capacity to induce NICTABA gene expression. The expression profile of NICTABA after caterpillar feeding was recorded in local as well as in systemic leaves, and compared to the expression of several genes encoding defense proteins, and genes encoding a tobacco systemin and the allene oxide cyclase, an enzyme in JA biosynthesis. Furthermore, the accumulation of NICTABA was quantified after S. littoralis herbivory and immunofluorescence microscopy was used to study the localization of NICTABA in the tobacco leaf

GalNAc/Gal-Binding Rhizoctonia solani Agglutinin Has Antiproliferative Activity in Drosophila melanogaster S2 Cells via MAPK and JAK/STAT Signaling

Rhizoctonia solani agglutinin, further referred to as RSA, is a lectin isolated from the plant pathogenic fungus Rhizoctonia solani. Previously, we reported a high entomotoxic activity of RSA towards the cotton leafworm Spodoptera littoralis. To better understand the mechanism of action of RSA, Drosophila melanogaster Schneider S2 cells were treated with different concentrations of the lectin and FITC-labeled RSA binding was examined using confocal fluorescence microscopy. RSA has antiproliferative activity with a median effect concentration (EC50) of 0.35 µM. In addition, the lectin was typically bound to the cell surface but not internalized. In contrast, the N-acetylglucosamine-binding lectin WGA and the galactose-binding lectin PNA, which were both also inhibitory for S2 cell proliferation, were internalized whereas the mannose-binding lectin GNA did not show any activity on these cells, although it was internalized. Extracted DNA and nuclei from S2 cells treated with RSA were not different from untreated cells, confirming inhibition of proliferation without apoptosis. Pre-incubation of RSA with N-acetylgalactosamine clearly inhibited the antiproliferative activity by RSA in S2 cells, demonstrating the importance of carbohydrate binding. Similarly, the use of MEK and JAK inhibitors reduced the activity of RSA. Finally, RSA affinity chromatography of membrane proteins from S2 cells allowed the identification of several cell surface receptors involved in both signaling transduction pathways

Diversity in Protein Glycosylation among Insect Species

status: publishe

Role of the jasmonate-inducible tobacco agglutinin in the defense against insect herbivory

Lectines zijn koolhydraat-bindende eiwitten die alomtegenwoordig zijn in planten. Hoewel plantlectines reeds lange tijd gekend zijn, is de biologisch rol van vele lectines nog steeds niet opgehelderd. Recent werd een lectine ontdekt, Nicotiana tabacum agglutinine of kortweg NICTABA genoemd, dat wordt geïnduceerd in bladeren van tabak door jasmijnzuur. Jasmijnzuur is een planthormoon dat een belangrijke rol speelt in de regulatie van de verdedigingsrespons in planten. In dit doctoraatsonderzoek werd de aanmaak van NICTABA als reactie tegen plaagorganismen onderzocht en werden de entomotoxische eigenschappen van NICTABA in detail bestudeerd. In hoofdstuk 2 werd aangetoond dat de verdedigingsrespons in tabak verschilt alnaargelang de beschadiger die de plant aanvalt. Verder werd ook het belang aangetoond van de voedingsstijl van een plantbeschadiger voor de inductie van NICTABA. Bijtende plaaginsecten zoals rupsen (de katoenbladrups Spodoptera littoralis en de pijlstaartvlinder Manduca sexta) en celzuigende plagen zoals spintmijten (Tetranychus urticae) induceren NICTABA, terwijl floeemzuigende insecten zoals bladluizen en witte vliegen (Myzus nicotianae en Trialeurodes vaporariorum) de expressie van het tabakslectine niet induceren. Bovendien werd aangetoond dat de aanmaak van NICTABA niet wordt geïnduceerd door componenten aanwezig in orale secreties, speekselklierextracten of uitwerpselen van de katoenbladrups. Planten reageren op insectenvraat door het aanmaken van een groep jasmijnzuur-derivaten die een belangrijke rol spelen voor de regulatie van de expressie van talrijke verdedigingsgenen. Een van deze jasmijnzuur-induceerbare genen in tabak is het gen coderend voor NICTABA. In hoofdstuk 3 werd dieper ingegaan op de aanmaak en omzetting van jasmijnzuur tijdens rupsenvraat. De tijdsafhankelijke accumulatie van verschillende jasmijnzuur-metabolieten in het blad werd verder gelinkt aan de aanmaak van NICTABA. Er werd aangetoond dat één van de onderzochte jasmijnzuur-analogen, OPDA genaamd, zeer actief is voor het induceren van NICTABA expressie. Wanneer jasmijnzuur chemisch wordt omgezet in een gehydroxyleerde, een gesulfateerde of een geglycosyleerde vorm verliest het planthormoon zijn activiteit. Daarnaast werd het expressieprofiel van NICTABA vergeleken met de expressie van gekende jasmijnzuur-induceerbare genen zoals de genen coderend voor proteinase inhibitoren, een systemine analoog en het alleen oxide cyclase. Ook werd de aanmaak van NICTABA gekwantificeerd met behulp van ELISA en werd fluorescentiemicroscopie gebruikt om de cellulaire lokalisatie van NICTABA te bestuderen in het blad na rupsenvraat. De resultaten bekomen in hoofdstukken 2 en 3 gaven aanleiding tot de hypothese dat NICTABA een belangrijke functie vervult als verdedigingseiwit tegen insectenvraat. Een voorwaarde om een direct entomotoxisch effect uit te oefenen op rupsen is een hoge resistentie tegen eiwitafbrekende enzymen aanwezig in de darm van rupsen. In hoofdstuk 4 werd aangetoond dat NICTABA aan deze voorwaarde voldoet. Om vervolgens het biologisch effect van NICTABA op de algemene fysiologie van plaagrupsen te bestuderen, werden transgene tabaksplanten aangemaakt waarin de expressie van NICTABA selectief werd uitgeschakeld door RNA interferentie. Wanneer deze transgene planten werden gebruikt in voedingsexperimenten, was duidelijk dat katoenbladrupsen op de transgene planten sneller ontwikkelden vergeleken met rupsen gevoed op niet-getransformeerde planten. Dit leverde een direct bewijs voor een entomotoxisch effect van NICTABA. In hoofdstuk 5 werd de activiteit van NICTABA op rupsen verder onderzocht door een wilde tabaksoort Nicotiana attenuata, waarin een functionele NICTABA expressie ontbreekt, te transformeren met het gen voor NICTABA. Overexpressie van NICTABA in deze wilde tabaksvariëteit resulteerde in een duidelijke vermindering van de gewichtstoename en ontwikkelingssnelheid van de katoenbladrups gevoed op deze transgene planten vergeleken met de controlegroep. Samen met de resultaten bekomen in hoofdstuk 4 werd hiermee duidelijk aangetoond dat NICTABA de resistentie van tabaksplanten tegen rupsenvraat sterk verhoogt. In hoofdstuk 6 werden mogelijke werkingswijzen van NICTABA na opname in het insect onderzocht. Verschillende insectencellijnen afkomstig van verschillende rupsenweefsels (middendarm, ovaria, embryo) werden gebruikt voor het vinden van bindingspartners. Eerst werd de inhiberende werking van NICTABA op de celvermeerdering van insectencellen geanalyseerd en werden vele kandidaat-targeteiwitten gevonden. Daarna werd recombinant NICTABA aangemaakt dat gebruikt werd om de cellulaire lokalisatie van NICTABA te bestuderen na opname door middendarmcellen van insecten

Nicotiana tabacum agglutinin expression in response to different biotic challengers

The induction of the Nicotiana tabacum agglutinin or NICTABA was studied in tobacco leaves infected with a necrotrophic pathogen (Botrytis cinerea) and compared to folivory by several pest arthropods. It was clearly demonstrated that B. cinerea does not induce NICTABA expression, while arthropod herbivory stimulates a strong NICTABA accumulation. In order to further investigate the importance of feeding style for inducing lectin expression, tobacco plants were challenged with several arthropods that use different feeding guilds. It was shown that chewing caterpillars (Spodoptera littoralis and Manduca sexta) and cell-content-feeding spider mites (Tetranychus urticae) induce NICTABA expression, while infestation with phloem-feeding herbivores such as aphids and whiteflies (Myzus nicotianae and Trialeurodes vaporariorum) does not result in NICTABA accumulation. The presence of elicitors for NICTABA induction in oral secretions, salivary extracts or excrement extracts from S. littoralis larvae, was investigated through repeated application of different secretions to punctured wounds and analysis of lectin expression. However, none of the treatments could induce the accumulation of NICTABA as did herbivory

Nicotiana tabacum agglutinin is active against Lepidopteran pest insects

A jasmonate-inducible lectin called Nicotiana tabacum agglutinin or NICTABA was found in tobacco (Nicotiana tabacum cv Samsun) leaves. Since NICTABA expression is also induced after insect herbivory, a role in the defence response of tobacco was suggested. In this report, a detailed analysis was made of the entomotoxic properties of NICTABA using different transgenic approaches. First, purified NICTABA was shown to be strongly resistant to proteolytic degradation by enzymes present in the Lepidopteran midgut. To address the question of whether NICTABA is also active against Lepidopteran larvae, transgenic N. tabacum plants that silence endogenous NICTABA expression were constructed using RNA interference. Feeding experiments with these transgenic N. tabacum plants demonstrated that silencing of NICTABA expression enhances the larval performance of the generalist pest insect Spodoptera littoralis. In a second transgenic approach, NICTABA was ectopically expressed in the wild diploid tobacco Nicotiana attenuata, a species that lacks a functional NICTABA gene. When these transgenic N. attenuata plants were used in feeding experiments with S. littoralis larvae, a clear reduction in mass gain and significantly slower development were observed. In addition, feeding experiments with the Solanaceae specialist, Manduca sexta, provided further evidence that NICTABA exerts clear entomotoxic effects on Lepidopteran larvae