Συνδυαστική μελέτη συσχετισμού των πολυμορφισμών στους υποδοχείς της FSH και της AMH σε πτωχές και καλές απαντήτριες στην IVF.

Η ωοθυλακιοτρόπος ορμόνη (FSH) είναι γλυκοπρωτεΐνη, η οποία παράγεται από τον πρόσθιο λοβό της υπόφυσης και η παραγωγή της ρυθμίζεται από τη γοναδορελίνη (GnRH) η οποία με την σειρά της εκκρίνεται από τον υποθάλαμο. Στις γυναίκες ο ρόλος της FSH είναι πολλαπλός: αυξάνει την παραγωγή ανασταλτίνης, διεγείρει την ανάπτυξη των ωοθυλακίων, προετοιμάζει τα ωοθυλάκια για την δράση της LH και προάγει την παραγωγή οιστρογόνων μαζί με την LH. Η δράση της στηρίζεται στην αλληλεπίδρασή της με τον υποδοχέα της (FSHR), η ενεργοποίηση του οποίου είναι απαραίτητη για την ορμονική λειτουργία της FSH. O υποδοχέας ανήκει σε μια μεγάλη οικογένεια πρωτεϊνών που ονομάζονται GPCRs (G protein-coupled receptor) και αποτελεί μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη, η οποία εντοπίζεται στις μεμβράνες κυττάρων της μήτρας, της ωοθήκης και των όρχεων. Το γονίδιο του υποδοχέα βρίσκεται στο χρωμόσωμα p21 και αποτελείται από περίπου 2.080 νουκλεοτίδια. Προηγούμενες μελέτες που έχουν γίνει στο γονίδιο του υποδοχέα της ορμόνης FSH έχουν ανιχνεύσει την ύπαρξη πολυμορφισμών μερικοί από τους οποίους είναι οι εξής: Asn680Ser, Ala189Val, Ile160Thr και Thr449Ile. Οι πολυμορφισμοί του γονιδίου του υποδοχέα της FSH φαίνεται ότι επηρεάζουν τον τρόπο πρόσδεσης της ορμόνης με τον υποδοχέα της μεταβάλλοντας μοριακούς μηχανισμούς φωσφορυλίωσης και γλυκοζυλίωσης με αποτέλεσμα μειωμένη δράση της ορμόνης. Πιο συγκεκριμένα, έχει φανεί ότι σε γυναίκες που πρόκειται να υποβληθούν σε IVF/ICSI η ωοθηκική διέγερση επηρεάζεται από το είδος ή τον αριθμό των αλληλομόρφων που φέρουν οι γυναίκες. Υπάρχουν πληθώρα μελετών τόσο στον ελληνικό πληθυσμό όσο και σε διεθνές επίπεδο που αφορούν στον συσχετισμό των διαφορετικών γονοτύπων με την ανταπόκριση των γυναικών σε πρωτόκολλα IVF/ICSI, ωστόσο οι απόψεις διίστανται ως προς το ποιος, τελικά, γονότυπος είναι περισσότερο ευνοϊκός για την επίτευξη της ωοθηκικής διέγερσης. Η AMH είναι μια διμερής γλυκοπρωτεΐνη η οποία ανήκει στην οικογένεια των αυξητικών παραγόντων TGF-β. Η AMH παράγεται από τα κοκκώδη κύτταρα των ωοθηκικών ωοθυλακίων. Αρχικά παράγεται από τα πρωτογενή ωοθυλάκια ; η παραγωγή της είναι υψηλότερη στα στάδια του δευτερογενούς και του πρώιμου τριτογενούς ωοθυλακίου (διαμέτρου μικρότερης από 4 χιλιοστά) και καθώς τα ωοθυλάκια αυξάνουν σε μέγεθος η παραγωγή της μειώνεται και στη συνέχεια σταματά. Η ΑΜΗ αντανακλά σε μεγάλο βαθμό την ωοθηκική εφεδρεία των γυναικών και αποτελεί προγνωστικό παράγοντα της απόκρισης των ωοθηκών σε επικείμενη προσπάθεια υποβοηθούμενης αναπαραγωγής. Η δράση της ορμόνης αυτής όπως και της FSH στηρίζεται στην αλληλεπίδραση της με μια πρωτεΐνη υποδοχέα η οποία ονομάζεται Müllerian inhibiting substance type II receptor (MISIIR) ή AMHRII. Όπως έχει δειχθεί από έρευνες, ο υποδοχέας της ΑΜΗ υπερεκφράζεται σε περιπτώσεις καρκίνου τόσο των ωοθηκών όσο και του μαστού. Η έρευνα για την ύπαρξη πολυμορφισμών στο γονίδιο του υποδοχέα οδήγησε στην εντόπιση πολυμορφισμών όπως ο −482 A>G, ο οποίος σχετίζεται με την δυσλειτουργία της ανάπτυξης των ωοθυλακίων σε γυναίκες από την Ιαπωνία. Ωστόσο, σχετικά με την υπογονιμότητα, οι ερευνητές δεν έχουν καταλήξει εάν τελικά υπάρχει κάποια συσχέτιση της ύπαρξης πολυμορφισμών με την ανταπόκριση γυναικών σε πρωτόκολλα IVF/ICSI. Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η μελέτη των πολυμορφισμών (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs) των υποδοχέων της ωοθυλακιοτρόπου ορμόνης (FSHR) και της αντι-μυλλέριου ορμόνης (AMHR) σε γυναίκες που συμμετέχουν σε πρωτόκολλο IVF/ICSI και σε ομάδα ελέγχου. Στόχος είναι η μελέτη της κατανομής των γονοτύπων στις 2 ομάδες γυναικών καθώς και η συνδυαστική μελέτη των γονοτύπων και ο συσχετισμός τους με παραμέτρους της IVF καθώς και την επίτευξη ή όχι εγκυμοσύνης. Στην παρούσα μελέτη θα χρησιμοποιηθούν συνολικά δείγματα από εκατόν ογδόντα (180) γυναίκες. Από το συνολικό δείγμα, οι ογδόντα (80) γυναίκες θα αποτελέσουν την ομάδα ελέγχου, ενώ οι υπόλοιπες εκατό (100) έχουν ακολουθήσει πρωτόκολλο IVF/ICSI στο τμήμα Εξωσωματικής Γονιμοποίησης του νοσοκομείου «ΑΛΕΞΑΝΔΡΑ» και μπορούν να διαχωριστούν σε πενήντα (50) καλές και πενήντα (50) πτωχές απαντήτριες.Aim The purpose of the present study was to investigate whether the combination of two polymorphisms found on human FSH receptor gene – FSHR (Ser680Asn), and on human AMH receptor gene - AMHRII (−482 A>G), respectively are related to the assisted reproduction outcome. Methods In this study we assessed the distribution of the genotypes of FSHR Ser680Asn and of AMHRII −482 A>G gene polymorphisms in an IVF/ICSI group consisting of 126 women undergoing IVF/ICSI treatment for infertility and a control group consisting of 100 fertile women. Genotypes were determined using real-time PCR to discriminate for the different genotypes. We also performed a combinational study of the 9 possible combinations of the two polymorphisms and investigated their respective frequency in Greek women. Results Real-time PCR genotyping results revealed three different genotypes for each gene; women homozygous for the normal allele, women heterozygous for the polymorphism and women homozygous for the polymorphism. Statistical analysis showed that the frequency of the genotypes is similar in both control and IVF/ICSI groups. Further investigation of the frequency of the 9 possible combinations of these polymorphisms in the groups revealed no correlation between infertility and combination of the polymorphisms. Conclusions Our results show that in the Greek population the distribution of the FSHR Ser680Asn and of the AMHRII −482 A>G gene polymorphisms, is similar in fertile and infertile women and that there is no correlation of clinical importance between these polymorphisms and infertility

Structural analysis of peptide-analogues of human Zona Pellucida ZP1 protein with amyloidogenic properties: insights into mammalian Zona Pellucida formation.

Zona pellucida (ZP) is an extracellular matrix surrounding and protecting mammalian and fish oocytes, which is responsible for sperm binding. Mammalian ZP consists of three to four glycoproteins, called ZP1, ZP2, ZP3, ZP4. These proteins polymerize into long interconnected filaments, through a common structural unit, known as the ZP domain, which consists of two domains, ZP-N and ZP-C. ZP is related in function to silkmoth chorion and in an evolutionary fashion to the teleostean fish chorion, also fibrous structures protecting the oocyte and embryo, that both have been proven to be functional amyloids. Two peptides were predicted as 'aggregation-prone' by our prediction tool, AMYLPRED, from the sequence of the human ZP1-N domain. Here, we present results from transmission electron microscopy, X-ray diffraction, Congo red staining and attenuated total reflectance Fourier-transform infrared spectroscopy (ATR FT-IR), of two synthetic peptide-analogues of these predicted 'aggregation-prone' parts of the human ZP1-N domain, that we consider crucial for ZP protein polymerization, showing that they both self-assemble into amyloid-like fibrils. Based on our experimental data, we propose that human ZP (hZP) might be considered as a novel, putative, natural protective amyloid, in close analogy to silkmoth and teleostean fish chorions. Experiments are in progress to verify this proposal. We also attempt to provide insights into ZP formation, proposing a possible model for hZP1-N domain polymerization

Combined study on the single nucleotide polymorphisms in the follicle-stimulating hormone receptor (Ser680Asn) and anti-Mullerian hormone receptor type II (-482A>G) as genetic markers in assisted reproduction

Background: Infertile women may have underlying genetic abnormalities. There is, at present, a significant number of studies on the relation between the follicle stimulating hormone receptor (FSHR) or anti-Mullerian hormone type II receptor (AMHRII) polymorphisms and response to in-vitro fertilisation (IVF) treatment. However, it is not yet clear which genotype or combination of genotypes is favourable towards a better ovarian stimulation and pregnancy outcome. Materials and methods: In this study we assessed the distribution of the genotypes of FSHR Ser680Asn and of AMHRII -482A>G gene polymorphisms in a group of 126 infertile women and a control group of 100 fertile women by using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). Results: Statistical analysis showed that the frequency of the genotypes is similar in both control and IVF/ intracytoplasmic sperm injection (ICSI) groups. Further investigation of the frequency of the nine possible combinations of these polymorphisms in the groups revealed no correlation between infertility and combination of the polymorphisms. Women with one polymorphism have on average 5.5 units higher levels of AMH compared to women carrying no polymorphism. In women with no polymorphisms, for each unit of FSH increase, the average concentration of blood AMH is expected to be 72% lower. Conclusion: The distribution of the FSHR Ser680Asn and of the AMHRII -482A>G gene polymorphisms, in the Greek population is similar in fertile and infertile women. The study showed that FSH and AMH correlated levels in certain cases could be used to estimate a patient’s ovarian reserve

Bands observed in the IR spectrum of a hydrated film produced from a suspension of fibrils produced by ZPH_A peptide, ZPH_G peptide and from a mixture of both peptides, dissolved in equal (1∶1) amounts and their tentative assignments (Fig. 5).

<p>Bands observed in the IR spectrum of a hydrated film produced from a suspension of fibrils produced by ZPH_A peptide, ZPH_G peptide and from a mixture of both peptides, dissolved in equal (1∶1) amounts and their tentative assignments (<a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0073258#pone-0073258-g005" target="_blank">Fig. 5</a>).</p

ATR FT-IR (1100–1800 cm⁻¹) spectra obtained from thin hydrated-films containing mature amyloid-like fibrils.

<p>These thin hydrated-films, formed from (a) ZPH_A, (b) ZPH_G and (c) the mixture of ZPH_A & ZPH_G peptides, were cast on flat stainless-steel plates coated with an ultra thin hydrophobic layer (see ‘<a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0073258#s2" target="_blank">Materials and methods</a>’). Second derivative spectra are also included and were used for the exact identification of the band maxima and their tentative assignments. All resulting spectra are indicative of the preponderance of an antiparallel β-sheet secondary structure (<a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0073258#pone-0073258-t002" target="_blank">Table 2</a>).</p

Sequence alignment of the ZP-N domain of mouse ZP3 and human ZP1 proteins.

<p>The crystallographically determined secondary structure elements are depicted below the sequences: Arrows and helices represent observed beta-strands (named consecutively A to G) and alpha helices, respectively. The invariant cysteine residues connected by disulfide bonds (dotted lines) are also seen. Peptides ATVQCF and FQLHVRC, corresponding to the beta strands A and G of human ZP1, respectively, predicted by AMYLPRED <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0073258#pone.0073258-Frousios1" target="_blank">[43]</a> as ‘aggregation-prone’ stretches, are enclosed in boxes (see ‘<a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0073258#s2" target="_blank">Materials and methods</a>’).</p

Electron micrographs of amyloid-like fibrils, negatively stained with 1% uranyl acetate.

<p>Amyloid-like fibrils were derived by self-assembly, from a 10 mg ml⁻¹ solution of peptides ZPH_A (a) and ZPH_G (b) in distilled water, pH 5.5. A solution of a mixture of the ZPH_A and ZPH_G peptides (in 1∶1 ratio, in distilled water, pH 5.5, concentration 5 mg ml⁻¹ per peptide) also revealed the formation of amyloid-like fibrils, after an incubation period of ca. one week (c). (a) They are unbranched and of undetermined length, approximately 100–120 Å in diameter and have a double helical structure. A pair of protofilaments each 40–50 Å in diameter wrap around each other, with intervening stain between them, thus forming double-helical fibrils (arrows). Bar 500 nm. (b) Protofilaments interact laterally, forming ribbons and, eventually, gels. The fibrils formed exhibit a characteristic for amyloid-like fibrils polymorphism <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0073258#pone.0073258-Kodali1" target="_blank">[67]</a>–<a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0073258#pone.0073258-Pedersen1" target="_blank">[69]</a>. Bar 200 nm. (c) Two different types (populations) of fibrils are apparent, due to “self-aggregation” of each peptide (double and single arrows, respectively), which are similar to those viewed separately by the ZPH_A and ZPH_G peptide solutions in (a) and (b) above. Bar 500 nm.</p

Photomicrographs of peptide fibrils stained with Congo red.

<p>Fibrils have derived from: ZPH_A (a–b), ZPH_G (c–d) and ZPH_A & ZPH_G mixture (e–f) peptides, respectively (see ‘<a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0073258#s2" target="_blank">Materials and methods</a>’). Solutions of these peptides, after ca. one (1) week incubation, produced fibrils, which were then stained with Congo red. The typical for amyloid fibrils apple-green birefringence is clearly seen, under crossed polars. (a,c,e) Bright field illumination, (b,d,f) Crossed polars Bar 400 µm.</p

X-ray diffraction patterns produced from oriented fibres of mature fibril suspensions.

<p>The mature fibrils have derived from: (a) ZPH_A peptide, (b) ZPH_G peptide, (c) a mixture of ZPH_A & ZPH_G peptides. The meridian, M (direction parallel to the fibre axis, F) is vertical and the equator, E, is horizontal in this display. All X-ray diffraction patterns are clearly “cross-β” patterns <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0073258#pone.0073258-Geddes1" target="_blank">[71]</a>–<a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0073258#pone.0073258-Jahn1" target="_blank">[73]</a>. (a) An intense meridional 4.7 Å reflection corresponds to the spacing of successive hydrogen bonded β-strands, perpendicular to the fiber axis, whereas the 9.1 Å reflection on the equator is attributed to the packing distance of β-sheets (<a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0073258#pone-0073258-t001" target="_blank">Table 1</a>, column 4). The sheets are packed parallel to the fiber axis. (b) The X-ray diffraction pattern of the ZPH_G peptide also exhibits similar reflections that indicate the presence of a “cross-β” conformation. The structural repeat of 4.7 Å corresponds to the spacing of successive β-strands arranged perpendicular to the fiber axis, while the 12.4 Å spacing on the equator, corresponds to the packing distance of consecutive β-sheet parallel to the fibre axis (<a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0073258#pone-0073258-t001" target="_blank">Table 1</a>, column 5). (c) The X-ray pattern produced from the mixture of the ZPH_A & ZPH_G peptide fibril suspensions is clearly a combination of the diffraction patterns produced by the individual fibers formed from the ZPH_A and ZPH_G peptide's fibril suspensions (<a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0073258#pone-0073258-t001" target="_blank">Table 1</a>, column 6). The 2.4 Å, 3.8 Å, 7.1 Å and 9.1 Å reflections are due to the presence of fibrils formed by the ZPH_A peptide, whereas the 12.4 Å reflection is produced by fibrils formed by the ZPH_G peptide (corresponding to β-sheet packing distance). The intense 4.7 Å reflection has contributions from both fibril populations and this is in agreement with the EM photograph of <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0073258#pone-0073258-g002" target="_blank">Fig. 2c</a>.</p