Detection and differentiation of human enteroviruses (polioviruses, ECHO viruses and Cocsackie B viruses) following enzymatic amplification (RTPCR) and restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis

Enteroviruses are non-enveloped RNA viruses belonging to the Picornaviridae family. Human enteroviruses are subgrouped into Polioviruses, ECHO viruses, the more recently discovered Enteroviruses types 68 to 71 and Coxsackie viruses type A and type B. Enteroviruses can either cause illness of varying severity or remain asymptomatic. Poliovirus types 1-3 have been associated with paralytic poliomyelitis and undifferentiated febrile illness particularly during the summer. Coxsackie B viruses have been associated with pleurodynia, aseptic meningitis, meningoencephalitis, myocarditis, pericarditis etc. Echoviruses, although they are less pathogenic, they can cause intestinal infections, meningitis etc. This study adresses the genotyping issue of Polioviruses, Coxsackie B viruses and ECHO viruses by introducing a combination of RT-PCR and RFLP analysis. The potential clinical diagnostic applications of the method are also being assessed with relevant infected clinical samples. Reference Polio, Coxsackie B and Echo enteroviruses have been genotyped by reverse transcriptase polymerase chain reaction amplification using a common consensus enteroviral primer pair designated UC53/UG52, followed by restriction endonuclease digestion of the generated amplicons with Haelll, Ddel, Hpall, Ncol, Styl and Aval and electrophoretic analysis of the resulting products.The Poliovirus reference strains have been completely differentiated, while the Coxsackie B and ECHO virus reference strains formed a much more variable viral group. These findings support the specificity of the described method for clinical diagnostic genotyping of polioviruses and demonstrate that the 440 bp long target sequence in the 5' NCR follows different evolutionary process in polio and non-polio enteroviruses that is particularly prominent between reference non-polio strains and their serotypically assigned clinical isolates.Το γένος των εντεροϊών αποτελείται από 64 μη ελυτροφόρους, μικρούς RNA ιούς, που ανήκουν στην οικογένεια Picornaviridae. Στο γένος αυτό συμπεριλαμβάνονται οι πολιοϊοί, οι ιοί Coxsackie Α και Β, οι ECHO ιοί και οι εντεροϊοί 68-71. Οι εντεροϊοί προκαλούν στον άνθρωπο ασθένειες ποικίλουσας σοβαρότητας, μπορεί όμως και να παραμείνουν ασυμπτωματικοί επί μακρόν. Η κατανομή τους είναι παγκόσμια και σε ήπια κλίματα η κυκλοφορία τους αυξάνεται στη διάρκεια του καλοκαιριού και στις αρχές του φθινοπώρου. Οι πολιοϊοί δύνανται να προκαλέσουν από παραλυτική πολιομυελίτιδα έως και αδιαφοροποίητη εμπύρετο νόσο, κυρίως κατά τη διάρκεια του καλοκαιριού. Οι Coxsackie Β ιοί, αντίστοιχα συνδέονται με πλευροδυνία, περικαρδίτιδα και μυοκαρδίτιδα, μηνιγγίτιδα και εγκεφαλίτιδα κλπ. Οι ECHO ιοί είναι οι λιγότερο παθογόνοι από τους εντεροϊούς μπορεί όμως να προκαλέσουν εντερικές λοιμώξεις, μηνιγγίτιδα κλπ. Με στόχο την μοριακή διαφοροποίηση των προτύπων στελεχών των πολιοϊών, των Coxsackie Β ιών και των ECHO ιών εφαρμόσθηκε η μέθοδος της Αλυσιδωτής Αντίδρασης της Πολυμεράσης (PCR), σε συνδυασμό με πολυμορφισμούς μήκους μετά από επώαση με περιοριστικά ένζυμα (RFLP). Για την αξιολόγηση της μεθόδου σε κλινικό επίπεδο έγινε εφαρμογή της σε ένα συνολικό αριθμό 63 κλινικών δειγμάτων. Για την PCR χρησιμοποιήθηκε το ζεύγος των κοινών, για τους εντεροϊούς, εκκινητικών μορίων UC53/UG52, τα οποία επεκτείνουν αλληλουχίες στην συντηρητική 5' μη κωδική περιοχή του γενώματος των εντεροϊών. Για την RFLP ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν τα περιοριστικά ένζυμα Haelll, Ddel, Ncol, Hpall, Styl και Aval. Σε αντίθεση με τους Coxsackie Β και τους ECHO ιούς, οι πολιοϊοί διαφοροποιήθηκαν πλήρως τόσο μεταξύ τους, όσο και με τους υπόλοιπους εντεροϊούς. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν την τελείως διαφορετική πορεία που ακολούθησαν οι διάφορες ομάδες των εντεροϊών, εξαιτίας των διαφορετικών εξελικτικών πιέσεων που ασκήθηκαν με την πάροδο του χρόνου στους ιούς αυτούς

Improved Genotyping Vaccine and Wild-Type Poliovirus Strains by Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis: Clinical Diagnostic Implications

The combination of preventive vaccination and diagnostic typing of viral isolates from patients with clinical poliomyelitis constitutes our main protective shield against polioviruses. The restriction fragment length polymorphism (RFLP) adaptation of the reverse transcriptase (RT)-PCR methodology has advanced diagnostic genotyping of polioviruses, although further improvements are definitely needed. We report here on an improved RFLP procedure for the genotyping of polioviruses. A highly conserved segment within the 5′ noncoding region of polioviruses was selected for RT-PCR amplification by the UC(53)-UG(52) primer pair with the hope that it would be most resistant to the inescapable genetic alteration-drift experienced by the other segments of the viral genome. Complete inter- and intratypic genotyping of polioviruses by the present RFLP method was accomplished with a minimum set of four restriction endonucleases (HaeIII, DdeI, NcoI, and AvaI). To compensate for potential genetic drift within the recognition sites of HaeIII, DdeI, or NcoI in atypical clinical samples, the RFLP patterns generated with HpaII and StyI as replacements were analyzed. The specificity of the method was also successfully assessed by RFLP analysis of 55 reference nonpoliovirus enterovirus controls. The concerted implementation of these conditional protocols for diagnostic inter- and intratypic genotyping of polioviruses was evaluated with 21 clinical samples with absolute success