Thorough investigation of the phenolic profile of reputable Greek honey varieties:varietal discrimination and floral markers identification using liquid chromatography–high-resolution mass spectrometry

Honey is a highly consumed commodity due to its potential health benefits upon certain consumption, resulting in a high market price. This fact indicates the need to protect honey from fraudulent acts by delivering comprehensive analytical methodologies. In this study, targeted, suspect and non-targeted metabolomic workflows were applied to identify botanical origin markers of Greek honey. Blossom honey samples (n = 62) and the unifloral fir (n = 10), oak (n = 24), pine (n = 39) and thyme (n = 34) honeys were analyzed using an ultra-high-performance liquid chromatography hybrid quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UHPLC-q-TOF-MS) system. Several potential authenticity markers were revealed from the application of different metabolomic workflows. In detail, based on quantitative targeted analysis, three blossom honey markers were found, namely, galangin, pinocembrin and chrysin, while gallic acid concentration was found to be significantly higher in oak honey. Using suspect screening workflow, 12 additional bioactive compounds were identified and semi-quantified, achieving comprehensive metabolomic honey characterization. Lastly, by combining non-targeted screening with advanced chemometrics, it was possible to discriminate thyme from blossom honey and develop binary discriminatory models with high predictive power. In conclusion, a holistic approach to assessing the botanical origin of Greek honey is presented, highlighting the complementarity of the three applied metabolomic approaches

Thorough Investigation of the Phenolic Profile of Reputable Greek Honey Varieties: Varietal Discrimination and Floral Markers Identification Using Liquid Chromatography–High-Resolution Mass Spectrometry

Honey is a highly consumed commodity due to its potential health benefits upon certain consumption, resulting in a high market price. This fact indicates the need to protect honey from fraudulent acts by delivering comprehensive analytical methodologies. In this study, targeted, suspect and non-targeted metabolomic workflows were applied to identify botanical origin markers of Greek honey. Blossom honey samples (n = 62) and the unifloral fir (n = 10), oak (n = 24), pine (n = 39) and thyme (n = 34) honeys were analyzed using an ultra-high-performance liquid chromatography hybrid quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UHPLC-q-TOF-MS) system. Several potential authenticity markers were revealed from the application of different metabolomic workflows. In detail, based on quantitative targeted analysis, three blossom honey markers were found, namely, galangin, pinocembrin and chrysin, while gallic acid concentration was found to be significantly higher in oak honey. Using suspect screening workflow, 12 additional bioactive compounds were identified and semi-quantified, achieving comprehensive metabolomic honey characterization. Lastly, by combining non-targeted screening with advanced chemometrics, it was possible to discriminate thyme from blossom honey and develop binary discriminatory models with high predictive power. In conclusion, a holistic approach to assessing the botanical origin of Greek honey is presented, highlighting the complementarity of the three applied metabolomic approaches

Development of methods for food authenticity assessment using high resolution mass spectrometry

Τρόφιμα όπως το μέλι και οι ελιές κατέχουν εξέχουσα θέση στην αγορά λόγω των ευεργετικών τους επιδράσεων στον ανθρώπινο οργανισμό. Αυτές οι ιδιότητες αποδίδονται κυρίως στα αντιοξειδωτικά που υπάρχουν σε αυτά τα τρόφιμα, τα οποία είναι ζωτικής σημασίας για τον ανθρώπινο οργανισμό. Κάθε τρόφιμο έχει ένα μοναδικό μεταβόλωμα που μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δακτυλικό αποτύπωμα. Μέσω αυτού, μπορούμε να διαφοροποιήσουμε τρόφιμα που διαφέρουν σε συγκεκριμένα χαρακτηριστικά, όπως η γεωγραφική και βοτανική προέλευσή τους, εξάγοντας πολύτιμες πληροφορίες σχετικά με την αυθεντικότητά τους και την πιθανή νοθεία τους. Έτσι, ο γενικός στόχος αυτής της διατριβής ήταν η ανάπτυξη μιας ολιστικής προσέγγισης για την ανίχνευση παράνομων πρακτικών στο μέλι και τις ελιές, ενώ ταυτόχρονα χαρακτηρίζει συνολικά αυτά τα προϊόντα με βάση το φαινολικό τους περιεχόμενο. Σε αυτό το πλαίσιο, χρησιμοποιήθηκε μια αναλυτική πλατφόρμα (UHPLC-HRMS) που μπορεί να ανακτήσει όσο το δυνατόν περισσότερη πληροφορία από τα δείγματα σε συνδυασμό με χημειομετρικά εργαλεία για τη δημιουργία ισχυρών μοντέλων πρόβλεψης. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκαν οι μεθοδολογίες για τον χαρακτηρισμό του φαινολικού περιεχομένου των Ελληνικών (Κεφάλαια 3 & 4) και των Πολωνικών ποικιλιών μελιού (Κεφάλαιο 3), καθώς και σημαντικών Ελληνικών ποικιλιών ελιάς (κεφάλαιο 5). Ταυτόχρονα, η χρήση σύγχρονων χημειομετρικών εργαλείων κατέστησε δυνατό τον προσδιορισμό μοναδικών βιοδεικτών για τη διάκριση των Ελληνικών και Πολωνικών μελιών, όπως το κινικό και το γεντισικό οξύ για το Ελληνικό μέλι ή την ακασετίνη και την Χρυσίνη για το Πολωνικό μέλι (Κεφάλαιο 3), ή η διαφοροποίηση των Ελληνικών μελιών σύμφωνα με την βοτανική προέλευσή τους, όπως ο φαινυλ-αιθυλ-εστέρας του καφεϊκού οξέος για τα ανθόμελα ή το ευδεσμικό οξύ για το θυμάρι, το γαλλικό οξύ για τη βελανιδιά και η ταξιφολίνη για το πευκόμελο (Κεφάλαιο 4). Τέλος, αποκαλύφθηκαν σημαντικοί βιοδείκτες από τη διάκριση των Ελληνικών ποικιλιών ελιάς που καλλιεργούνται σε διάφορες περιοχές της Ελλάδας, όπως το διυδροκουμαρικό οξύ και η 1,4 βενζοκινόνη για τις ελιές Καλαμών (Κεφάλαιο 5).Foods such as honey and olives held a prominent place in the market due to their beneficial effects on the human body. These properties are primarily attributed to the antioxidants in these foods, which are vital for the human body. Each food has a unique metabolome that can be used as a fingerprint. Through this, we can differentiate foods that differ in specific attributes, such as their geographical and botanical origin, extracting valuable information about their authenticity and possible adulteration. Thus, the overall objective of this thesis was to develop a holistic approach to detect fraudulent practices in honey and olives while simultaneously comprehensively characterizing these products based on their phenolic content. In this context, a high-end analytical platform (UHPLC-HRMS) that can acquire as much information as possible from the samples combined with chemometrics to build robust models is used in this thesis. Specifically, the build methodologies were used to characterize the phenolic content of Greek honey (Chapters 3 & 4) and Polish varieties (Chapter 3), as well as of important Greek olive cultivars (chapter 5). At the same time, utilizing modern chemometric methods makes it possible to determine unique biomarkers for discriminating Greek and Polish honeys, such as quinic and gentisic acid for Greek honey or acacetin and Chrysin for Polish honey (Chapter 3), or differentiating Greek honeys according to their botanical origins such as phenethyl caffeate for blossom honeys or eudesmic acid for thyme, gallic acid for oak and taxifolin for pine honey (Chapter 4). Finally, important biomarkers were revealed from the discrimination of Greek olive cultivars cultivated in different regions in Greece, such as dihydrocoumaric acid and 1,4 benzoquinone for Kalamata olives (Chapter 5)

Αριθμός, εντόπιση και κλινική σημειολογία μεταστατικών εστιών σε ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα προχωρημένου σταδίου: προγνωστική αξία

Εισαγωγή: Το μεταστατικό αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα αποτελεί νόσο με μεγάλη ετερογένεια, καθότι περιλαμβάνει όγκους με ποικίλα ιστοπαθολογικά, μοριακά και βιολογικά χαρακτηριστικά, που μεταφράζονται σε ποικίλες ανταποκρίσεις στη θεραπεία και κλινική έκβαση. Σκοπός: Στην παρούσα μελέτη διερευνήσαμε κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους πρόγνωσης σε ασθενείς με μεταστατικό EGFR/ALK wild-type αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα. Υλικά/Μέθοδοι: Έγινε αναδρομική μελέτη των ιατρικών φακέλων 54 ασθενών με μεταστατικό αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα χωρίς EGFR μεταλλάξεις ή αναδιάταξη ALK, που έλαβαν χημειοθεραπεία με ή χωρίς ακτινοβολία. Τα δημογραφικά και κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά των ασθενών (ηλικία, φύλο, ιστορικό καπνίσματος, performance status/PS, συννοσηρότητες, μέγεθος και εντόπιση του πρωτοπαθούς όγκου, ο αριθμός και εντόπιση των μεταστάσεων και θεραπεία) συσχετίσθηκαν με την επιβίωση ελεύθερη προόδου νόσου (progression-free survival/PFS) και τη συνολική επιβίωση (overall survival/OS), με τη χρήση μονοπαραγοντικής και πολυπαραγοντικής ανάλυσης παλινδρόμησης (regression analysis). Αποτελέσματα: Η μέση ηλικία (SD) των ασθενών ήταν 65 (9.9) έτη; στην πλειοψηφία τους ήταν άνδρες (70.4%), με PS 0-1 (74.1%). Τα οστά ήταν η συχνότερη μεταστατική εστία (57.4%), ακολουθούμενα από τα επινεφρίδια (35.2%), τον εγκέφαλο (35.2%) και το ήπαρ (31.5%). Η εντόπιση του πρωτοπαθούς όγκου (αριστερά) συσχετίσθηκε ανεξάρτητα με μειωμένο PFS [HR (95% CI): 1,96 (1,00 - 3,85); p=0,049], ενώ το μεγαλύτερο μέγεθος του πρωτοπαθούς όγκου και το χειρότερο PS (≥2) συσχετίσθηκαν ανεξάρτητα με χαμηλότερη συνολική επιβίωση/OS [HR (95% CI): 1,32 (1,07 - 1,63); p=0,049 and HR (95% CI): 6,39 (1,54 - 26,4); p=0,010, αντιστοίχως]. Συμπέρασμα: Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης, η εντόπιση και το μέγεθος του πρωτοπαθούς όγκου (καθώς και το PS) μπορεί να αποτελούν ανεξάρτητους προγνωστικούς δείκτες σε ασθενείς με μεταστατικό αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα αρνητικό για EGFR μεταλλάξεις και ALK αναδιάταξη.Background: Metastatic lung adenocarcinoma is a highly heterogeneous disease, comprising tumors with variable histopathological, molecular and biological features, translating into diverse treatment responses and clinical outcomes. We herein aimed to further investigate the clinicopathological predictors of prognosis among patients with metastatic EGFR/ALK wild-type lung adenocarcinoma. Methods: The medical records of 54 patients with metastatic lung adenocarcinoma, not harboring EGFR mutations or ALK rearrangements, and treated with chemotherapy with or without radiotherapy, were retrospectively studied. Demographic and clinicopathological features, including age, sex, smoking history, performance stauts (PS), comorbidities, primary tumor size and location, number and site of metastases and treatment data were correlated with progression-free survival (PFS) and overall survival (OS), using univariate and multiple regression analysis. Results: Mean age (SD) of patients was 65 (9.9) years; the majority were male (70.4%), with PS 0-1 (74.1%). Bones were the most common site of metastases (57.4%), followed by adrenal glands (35.2%), brain (35.2%) and liver (31.5%). Tumor location (left side) was independently correlated with reduced PFS [HR (95% CI): 1,96 (1,00 - 3,85); p=0,049], while increased size of the primary tumor and worse PS (≥2) were both independently associated with worse OS [HR (95% CI): 1,32 (1,07 - 1,63); p=0,049 and HR (95% CI): 6,39 (1,54 - 26,4); p=0,010, respectively]. Conclusions: Left-side location and increased size of the primary tumor, along with poor PS, were independent clinicopathological predictors of an unfavorable prognosis in our “real-world” cohort of patients with stage IV, EGFR/ALK wild-type lung adenocarcinoma

Ανάπτυξη μεθόδων για την αξιολόγηση της αυθεντικότητας των τροφίμων με χρήση φασματομετρίας μάζας υψηλής διακριτικής ικανότητας

Foods such as honey and olives held a prominent place in the market due to their beneficial effects on the human body. These properties are primarily attributed to the antioxidants in these foods, which are vital for the human body. Each food has a unique metabolome that can be used as a fingerprint. Through this, we can differentiate foods that differ in specific attributes, such as their geographical and botanical origin, extracting valuable information about their authenticity and possible adulteration. Thus, the overall objective of this thesis was to develop a holistic approach to detect fraudulent practices in honey and olives while simultaneously comprehensively characterizing these products based on their phenolic content. In this context, a high-end analytical platform (UHPLC-HRMS) that can acquire as much information as possible from the samples combined with chemometrics to build robust models is used in this thesis. Specifically, the build methodologies were used to characterize the phenolic content of Greek honey (Chapters 3 & 4) and Polish varieties (Chapter 3), as well as of important Greek olive cultivars (chapter 5). At the same time, utilizing modern chemometric methods makes it possible to determine unique biomarkers for discriminating Greek and Polish honeys, such as quinic and gentisic acid for Greek honey or acacetin and Chrysin for Polish honey (Chapter 3), or differentiating Greek honeys according to their botanical origins such as phenethyl caffeate for blossom honeys or eudesmic acid for thyme, gallic acid for oak and taxifolin for pine honey (Chapter 4). Finally, important biomarkers were revealed from the discrimination of Greek olive cultivars cultivated in different regions in Greece, such as dihydrocoumaricacid and 1,4 benzoquinone for Kalamata olives (Chapter 5).Τρόφιμα όπως το μέλι και οι ελιές κατέχουν εξέχουσα θέση στην αγορά λόγω των ευεργετικών τους επιδράσεων στον ανθρώπινο οργανισμό. Αυτές οι ιδιότητες αποδίδονται κυρίως στα αντιοξειδωτικά που υπάρχουν σε αυτά τα τρόφιμα, τα οποία είναι ζωτικής σημασίας για τον ανθρώπινο οργανισμό. Κάθε τρόφιμο έχει ένα μοναδικό μεταβόλωμα που μπορεί να χρησιμοποιηθείως δακτυλικό αποτύπωμα. Μέσω αυτού, μπορούμε να διαφοροποιήσουμε τρόφιμα που διαφέρουν σε συγκεκριμένα χαρακτηριστικά, όπως η γεωγραφική και βοτανική προέλευσή τους, εξάγοντας πολύτιμες πληροφορίες σχετικά με την αυθεντικότητά τους και την πιθανή νοθεία τους. Έτσι, ο γενικός στόχος αυτής της διατριβής ήταν η ανάπτυξη μιας ολιστικής προσέγγισης για την ανίχνευση παράνομων πρακτικών στο μέλι και τις ελιές, ενώ ταυτόχρονα χαρακτηρίζει συνολικά αυτά τα προϊόντα με βάση το φαινολικό τους περιεχόμενο. Σε αυτό το πλαίσιο, χρησιμοποιήθηκε μια αναλυτική πλατφόρμα (UHPLC-HRMS) που μπορεί να ανακτήσει όσο το δυνατόν περισσότερη πληροφορία από τα δείγματα σε συνδυασμό με χημειομετρικά εργαλεία για τη δημιουργία ισχυρών μοντέλων πρόβλεψης. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκαν οι μεθοδολογίες για τον χαρακτηρισμό του φαινολικού περιεχομένου των Ελληνικών (Κεφάλαια 3 & 4) και των Πολωνικών ποικιλιών μελιού (Κεφάλαιο 3), καθώς και σημαντικών Ελληνικών ποικιλιών ελιάς (κεφάλαιο 5). Ταυτόχρονα, η χρήση σύγχρονων χημειομετρικών εργαλείων κατέστησε δυνατό τον προσδιορισμό μοναδικών βιοδεικτών για τη διάκριση των Ελληνικών και Πολωνικών μελιών, όπως το κινικό και το γεντισικό οξύ για το Ελληνικό μέλι ή την ακασετίνη και την Χρυσίνη για το Πολωνικό μέλι (Κεφάλαιο 3), ή η διαφοροποίηση των Ελληνικών μελιών σύμφωνα με την βοτανική προέλευσή τους, όπως ο φαινυλ-αιθυλ-εστέρας του καφεϊκού οξέος για τα ανθόμελα ή το ευδεσμικό οξύ για το θυμάρι, το γαλλικό οξύ για τη βελανιδιά και η ταξιφολίνη για το πευκόμελο (Κεφάλαιο 4). Τέλος, αποκαλύφθηκαν σημαντικοί βιοδείκτες από τη διάκριση των Ελληνικών ποικιλιών ελιάς που καλλιεργούνται σε διάφορες περιοχές της Ελλάδας, 12 όπως το διυδροκουμαρικό οξύ και η 1,4 βενζοκινόνη για τις ελιές Καλαμών (Κεφάλαιο 5)

Development of Analytical Strategies for the Determination of Olive Fruit Bioactive Compounds Using UPLC-HRMS and HPLC-DAD. Chemical Characterization of <i>Kolovi</i> Lesvos Variety as a Case Study

In this study, an overall survey regarding the determination of several bioactive compounds in olive fruit is presented. Two methodologies were developed, one UPLC-Q-TOF-MS method for the determination of olive fruit phenolic compounds and one HPLC-DAD methodology targeting the determination of pigments (chlorophylls and carotenoids), tocopherols (α-, β, -γ, δ-) and squalene. Target and suspect screening workflows were developed for the thorough fingerprinting of the phenolic fraction of olives. Both methods were validated, presenting excellent performance characteristics, and can be used as reliable tools for the monitoring of bioactive compounds in olive fruit samples. The developed methodologies were utilized to chemical characterize the fruits of the Kolovi olive variety, originating from the island of Lesvos, North Aegean Region, Greece. Twenty-five phenolic compounds were identified and quantified in Kolovi olives with verbascoside, hydroxytyrosol, oleacein and oleomissional found in significantly high concentrations. Moreover, 12 new bioactive compounds were identified in the samples using an in-house suspect database. The results of pigments analysis suggested that Kolovi variety should be characterized as low pigmentation, while the tocopherol and squalene content was relatively high compared to other olive varieties. The characterization of Kolovi olive bioactive content highlighted the high nutritional and possible economic value of the Kolovi olive fruit

Development and validation of a high-throughput headspace solid-phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry methodology for target and suspect determination of honey volatiles

The determination of volatile compounds is essential for the chemical characterisation of honey's aroma and its correlation to its sensory profile and botanical origin. The present study describes the development, optimization and validation of a new, simple and reliable method for the determination of volatile compounds in honey using headspace solid-phase microextraction combined with gas chromatography/mass spectrometry (HS-SPME-GC-MS). The optimization of the SPME conditions showed that the ratio of honey: water (2:1) and the incubation temperature (60 °C) are the most critical parameters. Gas chromatography was performed with medium polar Varian CP-Select 624 column and the experimental Retention Index for a number of compounds was determined as an additional identification feature for suspect analysis. The simultaneous use of four internal standards chlorobenzene, benzophenone, 2-pentanol and 4-methyl-2-pentanone and matrix matched calibration enhanced method accuracy achieving recoveries 73–114 % and repeatability ranging between 3.9 and 19 % relative standard deviations. Furthermore, the superiority of the HS-SPME to static head space technique was verified exhibiting four-to nine-fold higher sensitivity. Target and suspect screening were applied to 30 Greek honey samples and 53 volatile compounds belonging to different chemical classes, such as alkanes, aldehydes, ketones, alcohols, and esters were identified with quantified concentrations ranging between 3.1 μg kg−1 (Limonene) up to 20 mg kg−1 (Benzeneacetaldehyde). Among the new findings is the detection of Myrtenol in Greek pine honey and 2,3-butanediol in Greek oak honey. The developed analytical protocol can be a valuable tool in order to chemically characterize honey based on the volatile content

Honey Phenolic Compound Profiling and Authenticity Assessment Using HRMS Targeted and Untargeted Metabolomics

Honey consumption is attributed to potentially advantageous effects on human health due to its antioxidant capacity as well as anti-inflammatory and antimicrobial activity, which are mainly related to phenolic compound content. Phenolic compounds are secondary metabolites of plants, and their content in honey is primarily affected by the botanical and geographical origin. In this study, a high-resolution mass spectrometry (HRMS) method was applied to determine the phenolic profile of various honey matrices and investigate authenticity markers. A fruitful sample set was collected, including honey from 10 different botanical sources (n = 51) originating from Greece and Poland. Generic liquid–liquid extraction using ethyl acetate as the extractant was used to apply targeted and non-targeted workflows simultaneously. The method was fully validated according to the Eurachem guidelines, and it demonstrated high accuracy, precision, and sensitivity resulting in the detection of 11 target analytes in the samples. Suspect screening identified 16 bioactive compounds in at least one sample, with abscisic acid isomers being the most abundant in arbutus honey. Importantly, 10 markers related to honey geographical origin were revealed through non-targeted screening and the application of advanced chemometric tools. In conclusion, authenticity markers and discrimination patterns were emerged using targeted and non-targeted workflows, indicating the impact of this study on food authenticity and metabolomic fields