Serology of Paracoccidioidomycosis Due to Paracoccidioides lutzii

Paracoccidioides lutzii is a new agent of paracoccidioidomycosis (PCM) and has its epicenter localized to the Central-West region of Brazil. Serological diagnosis of PCM caused by P. lutzii has not been established. This study aimed to develop new antigenic preparations from P. lutzii and to apply them in serological techniques to improve the diagnosis of PCM due to P. lutzii. Paracoccidioides lutzii exoantigens, cell free antigen (CFA), and a TCA-precipitated antigen were evaluated in immunodiffusion (ID) tests using a total of 89 patient sera from the Central-West region of Brazil. Seventy-two sera were defined as reactive for P. brasiliensis using traditional antigens (AgPbB339 and gp43). Non-reactive sera for traditional antigens (n = 17) were tested with different P. lutzii preparations and P. lutzii CFA showed 100% reactivity. ELISA was found to be a very useful test to titer anti-P. lutzii antibodies using P. lutzii-CFA preparations. Sera from patients with PCM due to P. lutzii presented with higher antibody titers than PCM due to P. brasiliensis and heterologous sera. in western blot, sera from patients with PCM due to P. lutzii were able to recognize antigenic molecules from the P. lutzii-CFA antigen, but sera from patients with PCM due to P. brasiliensis could not recognize any P. lutzii molecules. Due to the facility of preparing P. lutzii CFA antigens we recommend its use in immunodiffusion tests for the diagnosis of PCM due to P. lutzii. ELISA and western blot can be used as complementary tests.Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)Universidade Federal de São Paulo UNIFESP, Dept Microbiol Imunol & Parasitol, Disciplina Biol Celular, São Paulo, BrazilUniv Fed Mato Grosso do Sul UFMS, Fac Med FAMED, Campo Grande, MS, BrazilUniv Fed Mato Grosso UFMT, Nucleo Doencas Infecciosas & Trop, Cuiaba, Mato Grosso, BrazilUniversidade Federal de São Paulo UNIFESP, Dept Microbiol Imunol & Parasitol, Disciplina Biol Celular, São Paulo, BrazilFAPESP: 2012/06593-0FAPESP: 2009/54024-2Web of Scienc

Sorologia de paracoccidioidomicose por paracoccidioides lutzii

Até há pouco tempo pensava-se que Paracoccidioides brasiliensis fosse o único agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM). Entretanto, estudos recentes demonstraram se tratar de um complexo de espécies causando essa micose: P. brasilienis S1, PS2, PS3 e PS4. Uma nova espécie foi criada, Paracoccidioides lutzii que tem como epicentro a região centro-oeste do Brasil. A sorologia da PCM sempre foi feita com um exoantígeno tradicional da cepa P. brasiliensis B339 e por meio do teste de imunodifusão alcança 96% de positividade. Entretanto, alguns soros de pacientes da região centro-oeste do Brasil, com PCM comprovada, reagiam negativamente. Neste estudo, soros de pacientes com PCM comprovada, por exame direto a fresco ou exames histopatológicos, oriundos da região centro-oeste do Brasil foram estudados e testados com antígenos de P. brasiliensis e P. lutzii. À princípio, utilizamos como estratégia, exoantígeno de P. brasiliensis e gp43 para diagnosticar pacientes de PCM por P. brasiliensis. Os soros não reagentes foram testados com 3 diferentes preparações antigênicas de P. lutzii: i) exoantígeno de P. lutzii, ii) antígeno precipitado com ácido tricloroacétilco (AgTCA) e iii) Cell-free antigen (CFA). De 89 soros testados por imunodifusão contra exoantígeno de P. brasiliensise gp43, 72 foram reativos e classificados como sendo de pacientes de PCM por P. brasiliensis. Os 17 soros negativos foram testados por imunodifusão contra exoantígeno, AgTCA e CFA de P. lutzii. O exoantígeno forneceu 10 (58%) positivos, porém as reações for am muito fracas; o TCA forneceu 3 (17%) positivos, também com reações fracas; o CFA forneceu 17 (100%) positivos, com excelente reatividade e visibilidade das IV bandas. Por meio do teste de ELISA foi possível diferenciar os soros de pacientes de PCM por P. l utzii daqueles por P. brasiliensis utilizando como antígeno o CFA de P. lutzii. Os soros dos pacientes de PCM por P. lutzii apresentaram altos títulos quando comparados com soros de PCM por P. brasiliensis e soros heterólogos. Por Western-blot, soros de pacientes de PCM por P. lutzii reconhecem vários antígenos homólogos, enquanto soros de pacientes com PCM por P. brasiliensis não reconhecem antígenos de P. lutzii. Portanto, a preparação antigênica CFA de P. lutzii demonstra ser um excelente antígeno para o diagnóstico da PCM por P. lutzii.Dados abertos - Sucupira - Teses e dissertações (2013 a 2016

Caracterização de epitopos contendo resíduos de alfa-galactopiranosil em Paracoccidioides e outros fungos patogênicos

The main focus of this work was to find αGal epitopes (terminal α-galactopisyl) in fungi of medical importance, considering that there is little information regarding the possible roles of these glycotopes in pathogenic fungal systems. Our project aimed at expanding the group’s reported observation that yeast cells from Paracoccidioides brasiliensis Pb18 reacted with anti-αGal antibodies from chagasic patients (Ch-anti-αGal) on the cell wall and inside intracellular vacuoles. Those results were obtained during the characterization of αGal epitopes in extracellular vesicles produced by P. brasiliensis Pb18 and Pb3 using Ch-antiαGal and anti-αGal IgGs isolated from paracoccidioidomycosis patients, as well MOA lectin specific to Galα1,3Gal disaccharide. Our present confocal microscopy results using Ch-anti-αGal antibodies suggested the presence of αGal epitopes in Pb18, Pb3, Pb01, Histoplasma capsulatum, Candida albicans, Cryptococcus capsulatum, and Aspergillus fumigatus. The reactivity was visualized inside vacuoles and on the cell wall of mother cells and buds, especially at bud scar and bud necks. C. neoformans yeasts were labeled only at the cell wall in our experimental conditions. Ch-anti-αGal antibodies were also localized in the filamentous phase of Pb18 and H. capsulatum, mostly in the hyphae cytoplasm. In A. fumigatus, label predominated at the phialides surface. During the Pb18 mycelium to yeast phase, Ch-antiαGal antibodies intensely labeled transition round structures, thus suggesting a role in yeast formation. Additionally, the presence of αGal epitopes in the studied fungal species was strongly suggested by the effect of α-galactosidase treatment, which evoked intense cell aggregation. Altogether these results suggest the presence of αGal epitopes in several pathogenic fungi, both in the yeast and mycelium phases. An extended in silico analysis using fungal data banks has shown the presence of potential αgalactosyltransferase genes in all fungal species analyzed in this study, in view of the sequence homology with α-galactosyltransferases (αGTs) well described in Schizosaccharomyces pombe. We used as templates the sequences of seven α1,2- and three α1,3-galactosiltransferases. There were similar sequences to α1,2-GT GMH4 and GMH5 (GT34 family), as well to OTGs α1,3-GT (GT8 family). The gene expression of related genes was analyzed between mycelium and yeast phases. The RT-PCR results suggest, in our conditions, that the Pb01 GMH5-like gene was more transcribed than that from Pb3 and Pb18 in both phases. The GMH-like genes were considerably more expressed during the yeast phase in all isolates than in the mycelium phase. These results suggest that there are potential αGT genes being expressed in P. brasiliensis and P. lutzii, however the mRNA accumulation varies with the isolate, cell phase and culture conditions. The overall data presented in this thesis are totally original in the field of pathogenic fungi and upgrade the knowledge about αGal epitopes, which can potentially have important roles in pathogenesis of mycosis, thus mirroring what happens in Chaga’s disease.O objetivo central deste trabalho foi verificar a presença de epitopos αGal(α-galactopiranosil) em fungos de importância médica, considerando que esses glicotopos e seu papel em sistemas fúngicos são pouco conhecidos. O projeto visou expandir a observação publicada pelo grupo de que leveduras de Paracoccidioides brasiliensis Pb18 reagiram com anticorpos anti-αGal de pacientes chagásicos (Ch-anti-αGal) tanto na parede celular, como em vacúolos intracelulares. Essa observação foi realizada durante a caracterização de epitopos αGal em vesículas extracelulares oriundas de P. brasiliensis Pb18 e Pb3 utilizando Ch-anti-αGal e anticorpos anti-αGal isolados de pacientes com paracoccidioidomicose, além da lectina MOA, que se liga especificamente em resíduos terminais de Galα1,3Gal. Os resultados de microscopia confocal com anticorpos Ch-anti-αGal sugeriram a presença de epitopos αGal na parede celular (especialmente nas regiões de brotamento e cicatriz do broto) e no citoplasma de leveduras de Paracoccidioides Pb18, Pb3, Pb01, Histoplasma capsulatum e Candida albicans, como também na parede celular de leveduras de Cryptococcus neoformans. Além disso, houve marcação dos anticorpos em hifas de P. brasiliensis Pb18 e H. capsulatum, notadamente na região intracelular, bem como na a superfície de fiálides de Aspergillus fumigatus. Células de Pb18 em transição de micélio para levedura apresentaram intensa fluorescência em estruturas arredondadas, sugerindo um papel das moléculas reativas com Ch-anti-αGal na transição. A presença de epitopos αGal na superfície das espécies fúngicas estudadas foi sugerida adicionalmente pela ação da enzima α-galactosiltransferase, a qual provocou intensa agregação celular. Esses resultados sugerem que epitopos αGal são expressos em muitas espécies de fungos patogênicos, tanto em leveduras como em hifas. Uma extensa análise de bancos de dados mostrou a presença de genes de αgalactosiltransferases potenciais nos fungos estudados, dada a homologia das correspondentes sequências de aminoácidos com aquelas caracterizadas em Schizosacharomyces pombe. Nas buscas, foram usadas como molde sete sequências de α1,2- e três de α1,3-galactosiltransferases (αGT). Foram encontradas e analisadas sequências similares às α1,2-GT GMH5 e GMH4 (família GT34) e às α1,3-GT OTGs (família GT8). A expressão dos genes foi verificada nas fases de micélio e levedura. Os resultados de RT-PCR sugeriram que, em nossas condições experimentais, o gene GMH5-like de Pb01 foi mais expresso do que os correspondentes em Pb3 e Pb18 nas duas fases. Os genes GMH-like foram consideravelmente mais expressos durante a fase de levedura do que de micélio nos três isolados. Ou seja, genes potencias de αGT são expressos em P. brasiliensis e P. lutzii, porém o acúmulo de mRNA é fase dependente e varia com o isolado em nossas condições de cultura. Os dados apresentados neste trabalho de tese são totalmente originais em fungos patogênicos e ampliam o conhecimento sobre epitopos αGal, os quais podem potencialmente ter um papel nas micoses assim como acontece na doença de Chagas.Dados abertos - Sucupira - Teses e dissertações (2019

not available

Assumindo que os dados financeiros são gerados por um conjunto de componentes independentes (CI), iremos usar o modelo ICA-GARCH, uma alternativa aos modelos multivariados. Neste modelo a análise de componentes independentes serve para procurar os fatores latentes com heterocedasticidade condicional. Usou-se o algoritmo FastICA para estimar os componentes independentes e a matriz de pesos (A). Apó estimar os CI\2019s ajustou-se um modelo GARCH univariado para cada um deles, fazendo a previsão em seguida e comparando os resultados de diferentes números de CI\2019s usados. É fato que o modelo adotado reduz a complexidade de estimar modelos GARCH multivariados transformando-o em um número pequeno de modelos de volatidade univariados.not availabl

A) Individual serum ELISA titers (1/T) of 28 sera from patients with PCM due to <i>P. lutzii</i> (blue) compared to individual serum ELISA titers (1/T) of 28 sera from patients with PCM due to <i>P. brasiliensis</i> (red) reacting with Ag CFA-Pl EPM 208 (12.5 µg/ml).

<p>The <i>P. lutzii</i> sera presented ID + for <i>P. lutzii</i> CFA antigen and ID − for <i>P. brasiliensis</i> exoantigen (AgPbB339). The group of <i>P. brasiliensis</i> sera presented ID + for AgPbB339 antigen and ID − for <i>P. lutzii</i> CFA antigen. (<b>*</b>) represents <i>P. lutzii</i> gold standard serum and (<b>**</b>) represents sera that had a very weak cross reaction with <i>P. brasiliensis</i> exoantigen. <b>B</b>) Individual serum ELISA titers (1/T) of 28 sera from patients with PCM due to <i>P. lutzii</i> (blue) compared to individual serum ELISA titers (1/T) of 28 sera from patients with PCM due to <i>P. brasiliensis</i> (red) reacting with Ag Exo Pb B339 (10 µg/ml). The <i>P. lutzii</i> sera presented ID + for <i>P. lutzii</i> CFA antigen and ID − for <i>P. brasiliensis</i> exoantigen (AgPbB339). The group of <i>P. brasiliensis</i> sera presented ID + for AgPbB339 antigen and ID − for <i>P. lutzii</i> CFA antigen. (*) represents <i>P. lutzii</i> gold standard serum and (**) represents sera that had a very weak cross reaction with <i>P. brasiliensis</i> exoantigen. The same group of sera was used in A and B. <b>C</b>) ELISA median curves from sera from patients with PCM due to <i>P. lutzii</i>, PCM due to <i>P. brasiliensis</i>, and heterologous sera such as histoplasmosis, aspergillosis, sporotrichosis, and normal human serum. Antigen used was <i>P. lutzii</i> CFA (Ag CFA-Pl EPM 208 at 12.5 µg/ml). <b>D</b>) ELISA individual serum titers (1/T) of patients with PCM due to <i>P. lutzii</i>, <i>P. brasiliensis</i>, and heterologous sera such as Histoplasmosis, Aspergillosis, Sporotrichosis and normal human sera. By the end titer we could distinguish sera of PCM patients due to <i>P. lutzii</i> from sera of PCM due to <i>P. brasiliensis</i> and other mycotic diseases. Antigen used was <i>P. lutzii</i> CFA (Ag CFA-Pl EPM 208 at 12.5 µg/ml). Bars indicate the median.</p

Comparison of clinico-epidemiological and radiological features in paracoccidioidomycosis patients regarding serological classification using antigens from Paracoccidioides brasiliensis complex and Paracoccidioides lutzii.

Genotyping of the genus Paracoccidioides showed its diversity and geographical distribution. Four species constituting the Paracoccidioides brasiliensis complex and Paracoccidioides lutzii are etiological agents of paracoccidioidomycosis (PCM). However, there are no studies comparing the clinical and epidemiological aspects between PCM caused by the P. brasiliensis complex and by P. lutzii. Demographic and clinical data from 81 patients with PCM-confirmed by mycological and/or histopathological examination-from Mato Grosso do Sul state (Brazil) were studied. All patients underwent serology by immunodiffusion with antigens obtained from the P. brasiliensis complex (ExoPb and gp43) and Cell Free Antigens obtained from P.lutzii (CFAPl).The cases were classified regarding their serological profile into three groups: G1: PCM patients seropositive to ExoPb and/or gp43 and seronegative to CFAPl (n = 51), assumed to have PCM caused by P. brasiliensis complex; G2: PCM patients seronegative to gp43 and seropositive to CFAPl (n = 16), with PCM caused by P. lutzii; and G3: PCM patients seropositive to ExoPb or gp43 and seropositive to CFAPl (n = 14), with undetermined serological profile, was excluded from the analyses. The Fisher's exact test or the Mann-Whitney U test, and cluster analysis according to Ward's method and Euclidean distance were used to analyze the results. Patients with serological profile suggestive of P. lutzii lived predominantly in municipalities in the Central and Southern regions of the state, while those with serological profile indicative of the P. brasiliensis complex were distributed throughout the state. No differences were found between the two groups regarding gender, age, schooling, rural work, clinical form, severity, organs involved, intensity of pulmonary involvement, degree of anemia, erythrocyte sedimentation rate values, and therapeutic response. PCM patients with serological profile suggestive of P. lutzii and PCM patients with serological profile indicative of P. brasiliensis complex showed the same clinical and radiological presentations

A) Western blot assays showing the reactivity of sera from patients with PCM due to <i>P. lutzii</i> versus <i>P. lutzii</i>-CFA antigen.

<p>Hc, Asp, Sp and NHS: representative blots of heterologous sera and normal human sera (15 sera each). (*) = represents <i>P. lutzii</i> gold standard serum. <b>B</b>) Reactivity of sera from patients with PCM due to <i>P. brasiliensis</i> versus <i>P. lutzii</i>-CFA antigen. We could distinguish <i>P. brasiliensis</i> from <i>P. lutzii</i> sera, as only sera from patients with PCM due to <i>P. lutzii</i> recognize antigenic molecules from <i>P. lutzii</i>-CFA. <b>C</b>) Western blot assays showing the reactivity of sera from patients with PCM due to <i>P. brasiliensis</i> versus <i>P. brasiliensis</i>-CFA (strain B339). Gp43 is basically recognized by PCM sera due to <i>P. brasiliensis</i>. <b>D</b>) Reactivity of sera due to <i>P. lutzii</i> versus <i>P. brasiliensis</i>-CFA (strain B339).</p