Leucemia aguda infantil: caracterización clínico-biológica e investigación en modelo transgénico murino Sca 1-TEL-AML1

[ES]El trabajo de tesis realizado se divide en dos partes. La primera de ellas consiste en un estudio epidemiológico descriptivo, retrospectivo de serie de casos de todos los pacientes con leucemia linfoblástica aguda infantil estudiados en el Complejo Asistencial Universitario de Salamanca en los últimos 18 años . Estudiamos las variables clínico biológicas de estos pacientes así como posibles factores de riesgo comunes en este subgrupo de pacientes. A partir del estudio de las historias clínicas de estos pacientes y de su seguimiento en las consultas de Hospital de día hemos podido obtener las siguientes conclusiones: -No podemos afirmar que el peso elevado del paciente al nacimiento, la edad materna superior a 35 años, o determinadas profesiones paternas, factores de riesgo descritos en otras publicaciones, predominen en los pacientes con leucemia aguda de nuestro estudio. -La elevada frecuencia de antecedentes familiares de leucemia sugiere la presencia de factores genéticos de predisposición y/o susceptibilidad en estas familias. -La tasa materna de abortos de repetición fue tres veces superior a la esperada, pero dada la baja incidencia no permite concluir que los antecedentes de abortos en la madre sea un factor de riesgo de padecer leucemia. -La supervivencia de los niños con leucemia con mala respuesta a la prednisona y/o refractarios al tratamiento de primera línea es muy baja, siendo éste el factor pronóstico más importante. -La incidencia de leucemia aguda registrada en el Complejo Asistencial Universitario de Salamanca en el periodo comprendido entre 1996 y 2013 es similar a la descrita en nuestro país, y las características que presentan estos pacientes son superponibles a las encontradas en la literatura. -La supervivencia global de nuestra serie ha sido ligeramente superior a la estimada con una menor tasa de recaídas, lo que pone de manifiesto la importancia de que sean centros de referencia los que traten a estos pacientes para mejorar en lo posible su pronóstico. En una segunda fase pretende profundizar en el conocimiento sobre el papel del clon preleucémico en la biología de la leucemia infantil empleando un modelo murino de investigación con el objetivo de generar un modelo de ratón que exprese el gen TEL-AML1 en el compartimento de la célula stem hematopoyética y validarlo como modelo que mimetiza la enfermedad humana . Se consigue reproducir la leucemia linfoblástica B en el modelo murino Sca1 TELAML1 en el compartimento de la célula Stem encontrando una incidencia de 7,69% entre nuestra muestra de estudio. El modelo Sca1-TELAML1 generado puede ser de utilidad para estudiar los posibles eventos secundarios y/o factores de riesgo responsables de la transformación maligna del clon preleucémico

Leucemia aguda infantil: caracterización clínico-biológica e investigación en modelo trasngénico murino Sca 1-TEL-AML1

Trabajo presentado por Dña. Marta García Suquía para optar al Grado de Doctor, y realizado en el Departamento de Obstetricia, Ginecología y Pediatría de la Facultad de Medicina de la Universidad de Salamanca.El trabajo de tesis realizado se divide en dos partes. La primera de ellas consiste en un estudio epidemiológico descriptivo, retrospectivo de serie de casos de todos los pacientes con leucemia linfoblástica aguda infantil estudiados en el Complejo Asistencial Universitario de Salamanca en los últimos 18 años . Estudiamos las variables clínico biológicas de estos pacientes así como posibles factores de riesgo comunes en este subgrupo de pacientes. A partir del estudio de las historias clínicas de estos pacientes y de su seguimiento en las consultas de Hospital de día hemos podido obtener las siguientes conclusiones: -No podemos afirmar que el peso elevado del paciente al nacimiento, la edad materna superior a 35 años, o determinadas profesiones paternas, factores de riesgo descritos en otras publicaciones, predominen en los pacientes con leucemia aguda de nuestro estudio. -La elevada frecuencia de antecedentes familiares de leucemia sugiere la presencia de factores genéticos de predisposición y/o susceptibilidad en estas familias. -La tasa materna de abortos de repetición fue tres veces superior a la esperada, pero dada la baja incidencia no permite concluir que los antecedentes de abortos en la madre sea un factor de riesgo de padecer leucemia. -La supervivencia de los niños con leucemia con mala respuesta a la prednisona y/o refractarios al tratamiento de primera línea es muy baja, siendo éste el factor pronóstico más importante. -La incidencia de leucemia aguda registrada en el Complejo Asistencial Universitario de Salamanca en el periodo comprendido entre 1996 y 2013 es similar a la descrita en nuestro país, y las características que presentan estos pacientes son superponibles a las encontradas en la literatura. -La supervivencia global de nuestra serie ha sido ligeramente superior a la estimada con una menor tasa de recaídas, lo que pone de manifiesto la importancia de que sean centros de referencia los que traten a estos pacientes para mejorar en lo posible su pronóstico. En una segunda fase pretende profundizar en el conocimiento sobre el papel del clon preleucémico en la biología de la leucemia infantil empleando un modelo murino de investigación con el objetivo de generar un modelo de ratón que exprese el gen TEL-AML1 en el compartimento de la célula stem hematopoyética y validarlo como modelo que mimetiza la enfermedad humana . Se consigue reproducir la leucemia linfoblástica B en el modelo murino Sca1 TELAML1 en el compartimento de la célula Stem encontrando una incidencia de 7,69% entre nuestra muestra de estudio. El modelo Sca1-TELAML1 generado puede ser de utilidad para estudiar los posibles eventos secundarios y/o factores de riesgo responsables de la transformación maligna del clon preleucémico.Peer Reviewe

A new ETV6-RUNX1 in vivo model produces a phenocopy of the human Pb-ALL

Resumen del trabajo presentado al 57th American Society of Hematology (ASH) Annual Meeting and Exposition, celebrado en Orlando (Florida-US) del 5 al 8 de diciembre de 2015.-- et al.[Introduction]: The ETV6-RUNX1 fusion gene, the most common subtype of childhood pB-ALL, is acquired in utero, producing a persistent and hidden preleukemic clone. However, the underlying mechanism explaining how the preleukemic clone evolves to pB-ALL remains to be identified. The lack of genetically engineered human-like ETV6-RUNX1pB-ALL models has hampered our understanding of the pathogenesis of this disease. [Methods]: We have used a novel experimental approach to generate a murine strain that mimics the human ETV6-RUNX1 pB-ALL. We expressed ETV6-RUNX1 specifically in hematopoietic stem cells (HSC) of C57BL/6 x CBA mice by placing ETV6-RUNX1 under the control of the Sca1 promoter. Two founder mice were obtained for the Sca1-ETV6-RUNX1 transgene, which had normal gestation, were viable and developed normally. Sca1-ETV6-RUNX1 transgenic mice were characterized with respect to clinical, immunephenotypic and genetic characteristics. For the detection of shared secondary genomic alterations we analyzed three murine Sca1-ETV6-RUNX1 and 11 ETV6-RUNX1positive human pB-ALL and corresponding germline by whole-exome (WES) and whole-genome sequencing using a HiSeq 2500 (Illumina) platform.[Results]: In our transgenic murine model Sca1-ETV6-RUNX1 transgene expression was detected in HSCs, while there was no detectable expression in pro B cells or later stages of B-cell development, which mimics human ETV6-RUNX1 preleukemic biology. Sca1-ETV6-RUNX1 mice developed exclusively pB-ALL at a low penetrance (7.5%; 3 out of 40) with a CD19+B220+IgM- cell surface phenotype. Overall survival was not significantly reduced compared to wild-type mice (P value = 0.7901). pB-ALL in Sca1-ETV6-RUNX1 mice manifested with splenomegaly, disruption of splenic architecture, and appearance of blast cells in the peripheral blood (PB). All leukemic cells displayed clonal immature BCR rearrangement. Tumor pro B cells grew independent of IL-7 and were able to propagate the disease when transplanted into sub-lethally irradiated syngeneic recipient mice. Whole-exome sequencing of murine pB-ALL revealed in one mouse a deletion of three amino acids in the B-cell differentiation factor EBF1, which is well known in the context of human ETV6-RUNX1 leukemia. Additionally we found mutations in genes implicated in histone modification, i.e. in KDM5Ccausing a premature translation stop. We compared the genomic alterations detected in the mouse model to published genomic data of pediatric ETV6-RUNX1 pB-ALL and identified multiple copy number variations, which are shared between the murine and human ETV6-RUNX1 pB-ALL. Among them were copy number gains and losses including i.e. the tumorsuppressor locus CDKN2A/B with a well-known role in human and mouse pB-ALL. A high proportion of genes implicated in histone modification was also mutated in published data of human ETV6-RUNX1 positive pB-ALL. We validated this novel finding of recurrent alterations of histone modifying genes in both the murine model and the human disease using an independent human ETV6-RUNX1 cohort of 11 patients. In this cohort were able to reproduce this finding. Similar to the murine model, we also detected a missense mutation in the methyltransferase KDM5C in one patient of our cohort of ETV6-RUNX1positive patients.[Conclusion]: In summary, we have characterized a new Sca1-ETV6-RUNX1 mouse model and this is, to our knowledge the first model, which represents a phenocopy of the human pB-ALL. Sca1-ETV6-RUNX1 mice develop exclusively pB-ALL at a very low penetrance as it is the case in human ETV6-RUNX1 positive pB-ALL. The acquisition of secondary mutations in pB-ALL with a high proportion in histone modifying genes confers the second hit for the conversion of a preleukemic clone into the clinically overt ETV6-RUNX1 positive pB-ALL disease. These findings are important for encouraging novel interventions that might help to prevent or treat ETV6-RUNX1 positive childhood leukemias.Peer Reviewe

Infection exposure promotes ETV6-RUNX1 precursor B-cell leukemia via impaired H3K4 demethylases

ETV6-RUNX1 is associated with the most common subtype of childhood leukemia. As few ETV6-RUNX1 carriers develop precursor B-cell acute lymphocytic leukemia (pB-ALL), the underlying genetic basis for development of full-blown leukemia remains to be identified, but the appearance of leukemia cases in time-space clusters keeps infection as a potential causal factor. Here, we present in vivo genetic evidence mechanistically connecting preleukemic ETV6-RUNX1 expression in hematopoetic stem cells/precursor cells (HSC/PC) and postnatal infections for human-like pB-ALL. In our model, ETV6-RUNX1 conferred a low risk of developing pB-ALL after exposure to common pathogens, corroborating the low incidence observed in humans. Murine preleukemic ETV6-RUNX1 pro/preB cells showed high Rag1/2 expression, known for human ETV6-RUNX1 pB-ALL. Murine and human ETV6-RUNX1 pB-ALL revealed recurrent genomic alterations, with a relevant proportion affecting genes of the lysine demethylase (KDM) family. KDM5C loss of function resulted in increased levels of H3K4me3, which coprecipitated with RAG2 in a human cell line model, laying the molecular basis for recombination activity. We conclude that alterations of KDM family members represent a disease-driving mechanism and an explanation for RAG off-target cleavage observed in humans. Our results explain the genetic basis for clonal evolution of an ETV6-RUNX1 preleukemic clone to pB-ALL after infection exposure and offer the possibility of novel therapeutic approaches.J. Hauer has been supported by the German Children's Cancer Foundation, DJCLS 02R/2016, KKS A2016/07 and from the “Forschungskommission” of the medical faculty of the Heinrich Heine University. M. Müschen is an HHMI Faculty Scholar (HHMI-55108547) and supported by NIH/NCI through an Outstanding Investigator Award (R35CA197628) to M. Müschen, a Wellcome Trust Senior Investigator Award, the Leukemia and Lymphoma Society, the California Institute for Regenerative Medicine, the William Lawrence and Blanche Hughes Foundation. A. Borkhardt has been supported by the German Children's Cancer Foundation and the Federal Ministry of Education and Research, Bonn, Germany. Research in I. Sánchez-García's group is partially supported by FEDER and by MINECO (SAF2012-32810, SAF2015-64420-R and Red de Excelencia Consolider OncoBIOSAF2014-57791-REDC), Instituto de Salud Carlos III (PIE14/00066), ISCIII- Plan de Ayudas IBSAL 2015 Proyectos Integrados (IBY15/00003), by Junta de Castilla y León (BIO/SA51/15, CSI001U14, UIC-017, and CSI001U16), Fundacion Inocente Inocente and by the ARIMMORA project (European Union's Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013) under grant agreement no. 282891). I. Sánchez-García's lab is a member of the EuroSyStem and the DECIDE Network funded by the European Union under the FP7 program. A. Borkhardt and I. Sánchez-García have been supported by the German Carreras Foundation (DJCLS R13/26). Research in C. Vicente-Dueñas' group is partially supported by a “Miguel Servet” grant (CP14/00082-AES 2013-2016-FEDER) from the Instituto de Salud Carlos III (Ministerio de Economía y Competitividad) and by the Lady Tata International Award for Research in Leukaemia 2016–2017. A. Martín-Lorenzo and G. Rodríguez-Hernández were supported by FSE-Conserjería de Educación de la Junta de Castilla y León (CSI001-13 and CSI001-15, respectively).Peer Reviewe