Opposing effects of bisphosphonates and advanced glycation end-products on osteoblastic cells

Patients with long-standing Diabetes mellitus can develop osteopenia and osteoporosis. We have previously shown that advanced glycation endproducts reduce the bone-forming activity of osteoblasts. Bisphosphonates are used for the treatment of various bone disorders, since they reduce osteoclastic function and survival, and stimulate osteoblastic bone-forming capacity. In this work we have investigated whether bisphosphonates are able to revert advanced glycation endproducts-induced deleterious effects in osteoblasts. MC3T3E1 and UMR106 osteoblastic cells were incubated with control or advanced glycation endproducts-modified bovine serum albumin, in the presence or absence of different doses of the bisphosphonates Alendronate, Pamidronate or Zoledronate. After 24–72 h of culture, we evaluated their effects on cell proliferation and apoptosis, type-1 collagen production, alkaline and neutral phosphatase activity, and intracellular reactive oxygen species production. Advanced glycation endproducts significantly decreased osteoblast proliferation, alkaline phosphatase activity and type 1 collagen production, while increasing osteoblastic apoptosis and reactive oxygen species production. These effects were completely reverted by low doses (10−8 M) of bisphosphonates. High doses of bisphosphonates (10−4–10−5 M) were toxic for osteoblasts. Nifedipine (L-type calcium channel blocker) did not affect the advanced glycation endproducts-induced decrease in osteoblastic proliferation, although it blocked the reversion of this effect by 10−8 M Alendronate. Both advanced glycation endproducts and Alendronate inhibited the activity of intracellular neutral phosphatases. In conclusion, we show that bisphosphonates revert the deleterious actions of advanced glycation endproducts on osteoblastic cells, and that these effects of bisphosphonates depend on: (a) Ca2+ influx through L-type voltage-sensitive channels, and (b) blockage of advanced glycation endproducts-induced reactive oxygen species generation

Opposing effects of bisphosphonates and advanced glycation end-products on osteoblastic cells

Patients with long-standing Diabetes mellitus can develop osteopenia and osteoporosis. We have previously shown that advanced glycation endproducts reduce the bone-forming activity of osteoblasts. Bisphosphonates are used for the treatment of various bone disorders, since they reduce osteoclastic function and survival, and stimulate osteoblastic bone-forming capacity. In this work we have investigated whether bisphosphonates are able to revert advanced glycation endproducts-induced deleterious effects in osteoblasts. MC3T3E1 and UMR106 osteoblastic cells were incubated with control or advanced glycation endproducts-modified bovine serum albumin, in the presence or absence of different doses of the bisphosphonates Alendronate, Pamidronate or Zoledronate. After 24–72 h of culture, we evaluated their effects on cell proliferation and apoptosis, type-1 collagen production, alkaline and neutral phosphatase activity, and intracellular reactive oxygen species production. Advanced glycation endproducts significantly decreased osteoblast proliferation, alkaline phosphatase activity and type 1 collagen production, while increasing osteoblastic apoptosis and reactive oxygen species production. These effects were completely reverted by low doses (10−8 M) of bisphosphonates. High doses of bisphosphonates (10−4–10−5 M) were toxic for osteoblasts. Nifedipine (L-type calcium channel blocker) did not affect the advanced glycation endproducts-induced decrease in osteoblastic proliferation, although it blocked the reversion of this effect by 10−8 M Alendronate. Both advanced glycation endproducts and Alendronate inhibited the activity of intracellular neutral phosphatases. In conclusion, we show that bisphosphonates revert the deleterious actions of advanced glycation endproducts on osteoblastic cells, and that these effects of bisphosphonates depend on: (a) Ca2+ influx through L-type voltage-sensitive channels, and (b) blockage of advanced glycation endproducts-induced reactive oxygen species generation.Facultad de Ciencias Exacta

Opposing effects of bisphosphonates and advanced glycation end-products on osteoblastic cells

Patients with long-standing Diabetes mellitus can develop osteopenia and osteoporosis. We have previously shown that advanced glycation endproducts reduce the bone-forming activity of osteoblasts. Bisphosphonates are used for the treatment of various bone disorders, since they reduce osteoclastic function and survival, and stimulate osteoblastic bone-forming capacity. In this work we have investigated whether bisphosphonates are able to revert advanced glycation endproducts-induced deleterious effects in osteoblasts. MC3T3E1 and UMR106 osteoblastic cells were incubated with control or advanced glycation endproducts-modified bovine serum albumin, in the presence or absence of different doses of the bisphosphonates Alendronate, Pamidronate or Zoledronate. After 24–72 h of culture, we evaluated their effects on cell proliferation and apoptosis, type-1 collagen production, alkaline and neutral phosphatase activity, and intracellular reactive oxygen species production. Advanced glycation endproducts significantly decreased osteoblast proliferation, alkaline phosphatase activity and type 1 collagen production, while increasing osteoblastic apoptosis and reactive oxygen species production. These effects were completely reverted by low doses (10−8 M) of bisphosphonates. High doses of bisphosphonates (10−4–10−5 M) were toxic for osteoblasts. Nifedipine (L-type calcium channel blocker) did not affect the advanced glycation endproducts-induced decrease in osteoblastic proliferation, although it blocked the reversion of this effect by 10−8 M Alendronate. Both advanced glycation endproducts and Alendronate inhibited the activity of intracellular neutral phosphatases. In conclusion, we show that bisphosphonates revert the deleterious actions of advanced glycation endproducts on osteoblastic cells, and that these effects of bisphosphonates depend on: (a) Ca2+ influx through L-type voltage-sensitive channels, and (b) blockage of advanced glycation endproducts-induced reactive oxygen species generation.Facultad de Ciencias Exacta

Effect of Advanced Glycation Endproducts and Alendronate on osteoclastic development: possible mechanisms of action

Introducción: En la Diabetes Mellitus se ha descripto un incremento en el riesgo de fracturas, las cuales podrían asociarse a la acumulación de productos de glicación avanzada (AGEs) que alteran la función de los osteoclastos (Oc), células gigantes multinucleadas encargadas de resorber el hueso. Los bifosfonatos (BP), drogas ampliamente usadas en enfermedades óseas, inhiben la actividad resortiva de los Oc, aunque su uso en pacientes diabéticos es controversial. Objetivo: Estudiar el efecto de AGEs y alendronato sobre el desarrollo de Oc en cultivo, así como los posibles mecanismos involucrados en la acción de estos agentes. Materiales y Métodos: Se cocultivaron macrófagos Raw264.7 y osteoblastos UMR-106 durante 8 días, con BSA o AGE (50-200 μg/ml), con o sin alendronato (10-8–10-4M). Se evaluó el efecto de estas condiciones de cultivo sobre la formación de Oc (número de los mismos, y actividad de fosfatasa ácida tartrato-resistente [TRAP]), la expresión de RAGE (Receptor de AGEs) en los Oc, y la expresión del ligando de RANK (RANKL) en los osteoblastos por inmunofluorescencia indirecta. Resultados: Los AGEs (50-200 μg/ml) inhibieron en forma dosis-dependiente la TRAP (10-30 %) y el número de osteoclastos generados (55 %), similarmente a lo inducido por bajas dosis de alendronato (10-8M–10-6M). La coincubación de bajas dosis de alendronato con 100 μg/ml de AGEs no indujo una inhibición adicional a la de los AGEs sobre la actividad de TRAP o el número de Oc. Altos niveles de alendronato (10-5M–10-4M) inhibieron la actividad TRAP (20-25 % respecto a BSA y 17 % respecto de AGEs), así como el número de Oc desarrollados en presencia de AGEs (16 % con respecto a AGEs). Los Oc incubados en presencia de 100 μg/ml AGEs mostraron un incremento significativo en la expresión de RAGE (152 % respecto de BSA), situación similar a la observada postincubación con alendronato 10-8M (130 % respecto de BSA). Por el contrario, altas dosis de alendronato (10-5M) no modificaron la expresión del RAGE en los cocultivos incubados con BSA (95 % respecto de BSA). Por otro lado, bajas dosis de alendronato en presencia de AGEs no alteraron la “up-regulation” del RAGE inducida por los AGEs (145 % respecto de BSA). Sin embargo, cuando los Oc se incubaron con AGEs y Ale 10-5M, esta dosis del bifosfonato bloqueó el efecto estimulante de los AGEs sobre la expresión de RAGE (105 % respecto de BSA). La incubación con 100 μg/ml AGE produjo una inhibición (50 % respecto de BSA), en la expresión del RANKL en los osteoblastos. El alendronato (10-8M–10-5M) indujo también una inhibición del RANKL en forma dosis dependiente (65-47 % respecto de BSA). Por otro lado en presencia de AGEs, el alendronato (10-8M–10-5M) no modificó la inhibición de la expresión del RANKL inducida por los AGEs (59-45 % del BSA). Conclusiones: Los AGEs y el alendronato inhiben el número y diferenciación de Oc en cultivo, con un efecto aditivo entre ambos a altas concentraciones de alendronato. También reducen la expresión de RANKL en osteoblastos, lo cual podría explicar parcialmente sus efectos sobre el reclutamiento y la maduración de Oc. Los AGEs y bajas dosis de alendronato aumentan la expresión de RAGE en Oc.Introduction: Patients with Diabetes mellitus frequently show osteopenia and/or osteoporosis, as well as an increase in low-trauma fracture risk. This has been postulated to be caused partially by the accumulation of advanced glycation endproducts (AGEs) in bone extracellular matrix. AGEs could affect the homeostasis of bone cells, such as osteoblasts, osteocytes and osteoclasts. Osteoclasts (Oc) are multi-nucleated cells specialized in resorbing bone. Bisphosphonates (BP) are drugs widely used for treatment of bone diseases, and their principal mechanism of action is to inhibit the resorptive action of Oc. However, the use of BP for the treatment of patients with Diabetes-related bone disease is still controversial. Objective: To study the effect of AGEs and Alendronate (an N-containing BP) on the development of Oc in culture, as well as possible mechanisms of action involved in these effects. Materials and Methods: RAW264.7 macrophages and UMR106 osteoblasts were co-cultured for 8 days, with BSA or AGEs (50-200 μg/ml), with or without Alendronate (10-8–10-4M). The effect of these culture conditions on Oc formation was evaluated (number of Oc, cell-associated tartrate-resistant acid phosphatase [TRAP] activity), as well as Oc expression of RAGE (receptor for AGEs), and osteoblastic expression of RANK ligand (RANKL). These last two parameters were evaluated by indirect immunofluorescence, in order to estimate the expression and sub-cellular distribution of both membrane-associated proteins. Results: AGEs (50-200 μg/ml) dose-dependently inhibited TRAP activity (10-30 %) and the number of multinucleated Oc (55 %). Similar results were observed for low doses of Alendronate (10-8M–10-6M). The co-incubation of low doses of Alendronate with 100 mg/ml of AGEs, did not induce an additional inhibition of TRAP activity or Oc number, to that observed for AGEs alone. High levels of Alendronate (10-5M–10-4M) inhibited Oc TRAP activity (20-25 % inhibition versus BSA, and 17 % versus AGEs), and also decreased the number of Oc formed in the presence of AGEs (16 % inhibition versus AGEs). Oc incubated in the presence of 100 μg/ml AGEs, showed a significant increase in the expression of RAGE (152 % versus BSA). Similar results were found after incubating with 10-8M Alendronate (130 % versus BSA). On the contrary, high doses of Alendronate (10-5M) did not affect the expression of RAGE in co-cultures incubated with BSA (95 % versus BSA). On the other hand, low doses of Alendronate in the presence of AGEs, did not affect the up-regulation of RAGE induced by AGEs (145 % versus BSA). However, when the Oc were co-incubated with AGEs and 10-5M Alendronate, this dose of BP was able to block the stimulation of RAGE expression induced by AGEs (105 % versus BSA). In osteoblasts, incubation with 100 μg/ml AGEs induced an inhibition in the expression of RANKL (50 % versus BSA). Alendronate (10-8M-10-5M) also inhibited RANKL expression in a dose-dependent manner (65-47 % versus BSA). However, Alendronate (10-8M–10-5M) did not modify the AGEs-induced inhibition in osteoblastic RANKL expression (59-45 % versus BSA). Conclusions: AGEs and Alendronate inhibit the number and differentiation of Oc in culture, with an additive effect for both agents at high Alendronate concentrations. AGEs and Alendronate also reduce the osteoblastic expression of RANKL, which could partially explain their effects on the recruitment and maturation of Oc. In addition, AGEs and low doses of Alendronate increase the expression of RAGE in cultured Oc, and this effect correlates with their inhibition of Oc development.Laboratorio de Investigación en Osteopatías y Metabolismo Minera

Laboratorio de Investigaciones en Osteopatías y Metabolismo Mineral: un enfoque multidisciplinario para el tratamiento de osteopatías de origen metabólico

El Laboratorio de Investigaciones en Osteopatías y Metabolismo Mineral (LIOMM) se creó en el año 2012 como una unidad multidisciplinaria dedicada a la investigación científico-tecnológica, con el fin de incrementar los conocimientos científicos, la educación y la extensión en el campo de las patologías óseas y metabólicas, así como su aplicación en la ingeniería de tejidos. Nuestras áreas de interés son: osteopatías, metabolismo mineral, diabetes mellitus, síndrome metabólico, ingeniería de tejido. Se abordan aspectos de la fisiopatología del esqueleto asociados con enfermedades metabólicas de alta prevalencia como la diabetes mellitus, síndrome metabólico y obesidad. Se investigan las posibles causas de estas osteopatías metabólicas, sus tratamientos con diferentes fármacos, así como terapia celular utilizando células progenitoras de médula ósea. Para contribuir al espectro terapéutico disponible para las distintas patologías oseocartilaginosas, se desarrollan y estudian matrices poliméricas que sirvan como sistemas de liberación controlada de drogas o como scaffolds para la reparación de tejido oseoarticular. Contamos con la colaboración de investigadores clínicos (osteólogos, endocrinólogos) del país, investigadores básicos (INIFTA, IFLYSIB, Universidad de Rosario) y grupos del extranjero, en particular de España (Universidad Politécnica de Valencia, Universidad de Oviedo, Instituto de Bioingeniería de Cataluña, IBEC) y de Estados Unidos (Universidad de Florida, Gainesville).Trabajo presentado por el Laboratorio de Investigaciones en Osteopatías y Metabolismo Mineral (LIOMM

Effect of Advanced Glycation Endproducts and Alendronate on osteoclastic development: possible mechanisms of action

Introducción: En la Diabetes Mellitus se ha descripto un incremento en el riesgo de fracturas, las cuales podrían asociarse a la acumulación de productos de glicación avanzada (AGEs) que alteran la función de los osteoclastos (Oc), células gigantes multinucleadas encargadas de resorber el hueso. Los bifosfonatos (BP), drogas ampliamente usadas en enfermedades óseas, inhiben la actividad resortiva de los Oc, aunque su uso en pacientes diabéticos es controversial. Objetivo: Estudiar el efecto de AGEs y alendronato sobre el desarrollo de Oc en cultivo, así como los posibles mecanismos involucrados en la acción de estos agentes. Materiales y Métodos: Se cocultivaron macrófagos Raw264.7 y osteoblastos UMR-106 durante 8 días, con BSA o AGE (50-200 μg/ml), con o sin alendronato (10-8–10-4M). Se evaluó el efecto de estas condiciones de cultivo sobre la formación de Oc (número de los mismos, y actividad de fosfatasa ácida tartrato-resistente [TRAP]), la expresión de RAGE (Receptor de AGEs) en los Oc, y la expresión del ligando de RANK (RANKL) en los osteoblastos por inmunofluorescencia indirecta. Resultados: Los AGEs (50-200 μg/ml) inhibieron en forma dosis-dependiente la TRAP (10-30 %) y el número de osteoclastos generados (55 %), similarmente a lo inducido por bajas dosis de alendronato (10-8M–10-6M). La coincubación de bajas dosis de alendronato con 100 μg/ml de AGEs no indujo una inhibición adicional a la de los AGEs sobre la actividad de TRAP o el número de Oc. Altos niveles de alendronato (10-5M–10-4M) inhibieron la actividad TRAP (20-25 % respecto a BSA y 17 % respecto de AGEs), así como el número de Oc desarrollados en presencia de AGEs (16 % con respecto a AGEs). Los Oc incubados en presencia de 100 μg/ml AGEs mostraron un incremento significativo en la expresión de RAGE (152 % respecto de BSA), situación similar a la observada postincubación con alendronato 10-8M (130 % respecto de BSA). Por el contrario, altas dosis de alendronato (10-5M) no modificaron la expresión del RAGE en los cocultivos incubados con BSA (95 % respecto de BSA). Por otro lado, bajas dosis de alendronato en presencia de AGEs no alteraron la “up-regulation” del RAGE inducida por los AGEs (145 % respecto de BSA). Sin embargo, cuando los Oc se incubaron con AGEs y Ale 10-5M, esta dosis del bifosfonato bloqueó el efecto estimulante de los AGEs sobre la expresión de RAGE (105 % respecto de BSA). La incubación con 100 μg/ml AGE produjo una inhibición (50 % respecto de BSA), en la expresión del RANKL en los osteoblastos. El alendronato (10-8M–10-5M) indujo también una inhibición del RANKL en forma dosis dependiente (65-47 % respecto de BSA). Por otro lado en presencia de AGEs, el alendronato (10-8M–10-5M) no modificó la inhibición de la expresión del RANKL inducida por los AGEs (59-45 % del BSA). Conclusiones: Los AGEs y el alendronato inhiben el número y diferenciación de Oc en cultivo, con un efecto aditivo entre ambos a altas concentraciones de alendronato. También reducen la expresión de RANKL en osteoblastos, lo cual podría explicar parcialmente sus efectos sobre el reclutamiento y la maduración de Oc. Los AGEs y bajas dosis de alendronato aumentan la expresión de RAGE en Oc.Introduction: Patients with Diabetes mellitus frequently show osteopenia and/or osteoporosis, as well as an increase in low-trauma fracture risk. This has been postulated to be caused partially by the accumulation of advanced glycation endproducts (AGEs) in bone extracellular matrix. AGEs could affect the homeostasis of bone cells, such as osteoblasts, osteocytes and osteoclasts. Osteoclasts (Oc) are multi-nucleated cells specialized in resorbing bone. Bisphosphonates (BP) are drugs widely used for treatment of bone diseases, and their principal mechanism of action is to inhibit the resorptive action of Oc. However, the use of BP for the treatment of patients with Diabetes-related bone disease is still controversial. Objective: To study the effect of AGEs and Alendronate (an N-containing BP) on the development of Oc in culture, as well as possible mechanisms of action involved in these effects. Materials and Methods: RAW264.7 macrophages and UMR106 osteoblasts were co-cultured for 8 days, with BSA or AGEs (50-200 μg/ml), with or without Alendronate (10-8–10-4M). The effect of these culture conditions on Oc formation was evaluated (number of Oc, cell-associated tartrate-resistant acid phosphatase [TRAP] activity), as well as Oc expression of RAGE (receptor for AGEs), and osteoblastic expression of RANK ligand (RANKL). These last two parameters were evaluated by indirect immunofluorescence, in order to estimate the expression and sub-cellular distribution of both membrane-associated proteins. Results: AGEs (50-200 μg/ml) dose-dependently inhibited TRAP activity (10-30 %) and the number of multinucleated Oc (55 %). Similar results were observed for low doses of Alendronate (10-8M–10-6M). The co-incubation of low doses of Alendronate with 100 mg/ml of AGEs, did not induce an additional inhibition of TRAP activity or Oc number, to that observed for AGEs alone. High levels of Alendronate (10-5M–10-4M) inhibited Oc TRAP activity (20-25 % inhibition versus BSA, and 17 % versus AGEs), and also decreased the number of Oc formed in the presence of AGEs (16 % inhibition versus AGEs). Oc incubated in the presence of 100 μg/ml AGEs, showed a significant increase in the expression of RAGE (152 % versus BSA). Similar results were found after incubating with 10-8M Alendronate (130 % versus BSA). On the contrary, high doses of Alendronate (10-5M) did not affect the expression of RAGE in co-cultures incubated with BSA (95 % versus BSA). On the other hand, low doses of Alendronate in the presence of AGEs, did not affect the up-regulation of RAGE induced by AGEs (145 % versus BSA). However, when the Oc were co-incubated with AGEs and 10-5M Alendronate, this dose of BP was able to block the stimulation of RAGE expression induced by AGEs (105 % versus BSA). In osteoblasts, incubation with 100 μg/ml AGEs induced an inhibition in the expression of RANKL (50 % versus BSA). Alendronate (10-8M-10-5M) also inhibited RANKL expression in a dose-dependent manner (65-47 % versus BSA). However, Alendronate (10-8M–10-5M) did not modify the AGEs-induced inhibition in osteoblastic RANKL expression (59-45 % versus BSA). Conclusions: AGEs and Alendronate inhibit the number and differentiation of Oc in culture, with an additive effect for both agents at high Alendronate concentrations. AGEs and Alendronate also reduce the osteoblastic expression of RANKL, which could partially explain their effects on the recruitment and maturation of Oc. In addition, AGEs and low doses of Alendronate increase the expression of RAGE in cultured Oc, and this effect correlates with their inhibition of Oc development.Laboratorio de Investigación en Osteopatías y Metabolismo Minera

Effect of Advanced Glycation Endproducts and Alendronate on osteoclastic development: possible mechanisms of action

Introducción: En la Diabetes Mellitus se ha descripto un incremento en el riesgo de fracturas, las cuales podrían asociarse a la acumulación de productos de glicación avanzada (AGEs) que alteran la función de los osteoclastos (Oc), células gigantes multinucleadas encargadas de resorber el hueso. Los bifosfonatos (BP), drogas ampliamente usadas en enfermedades óseas, inhiben la actividad resortiva de los Oc, aunque su uso en pacientes diabéticos es controversial. Objetivo: Estudiar el efecto de AGEs y alendronato sobre el desarrollo de Oc en cultivo, así como los posibles mecanismos involucrados en la acción de estos agentes. Materiales y Métodos: Se cocultivaron macrófagos Raw264.7 y osteoblastos UMR-106 durante 8 días, con BSA o AGE (50-200 μg/ml), con o sin alendronato (10-8–10-4M). Se evaluó el efecto de estas condiciones de cultivo sobre la formación de Oc (número de los mismos, y actividad de fosfatasa ácida tartrato-resistente [TRAP]), la expresión de RAGE (Receptor de AGEs) en los Oc, y la expresión del ligando de RANK (RANKL) en los osteoblastos por inmunofluorescencia indirecta. Resultados: Los AGEs (50-200 μg/ml) inhibieron en forma dosis-dependiente la TRAP (10-30 %) y el número de osteoclastos generados (55 %), similarmente a lo inducido por bajas dosis de alendronato (10-8M–10-6M). La coincubación de bajas dosis de alendronato con 100 μg/ml de AGEs no indujo una inhibición adicional a la de los AGEs sobre la actividad de TRAP o el número de Oc. Altos niveles de alendronato (10-5M–10-4M) inhibieron la actividad TRAP (20-25 % respecto a BSA y 17 % respecto de AGEs), así como el número de Oc desarrollados en presencia de AGEs (16 % con respecto a AGEs). Los Oc incubados en presencia de 100 μg/ml AGEs mostraron un incremento significativo en la expresión de RAGE (152 % respecto de BSA), situación similar a la observada postincubación con alendronato 10-8M (130 % respecto de BSA). Por el contrario, altas dosis de alendronato (10-5M) no modificaron la expresión del RAGE en los cocultivos incubados con BSA (95 % respecto de BSA). Por otro lado, bajas dosis de alendronato en presencia de AGEs no alteraron la “up-regulation” del RAGE inducida por los AGEs (145 % respecto de BSA). Sin embargo, cuando los Oc se incubaron con AGEs y Ale 10-5M, esta dosis del bifosfonato bloqueó el efecto estimulante de los AGEs sobre la expresión de RAGE (105 % respecto de BSA). La incubación con 100 μg/ml AGE produjo una inhibición (50 % respecto de BSA), en la expresión del RANKL en los osteoblastos. El alendronato (10-8M–10-5M) indujo también una inhibición del RANKL en forma dosis dependiente (65-47 % respecto de BSA). Por otro lado en presencia de AGEs, el alendronato (10-8M–10-5M) no modificó la inhibición de la expresión del RANKL inducida por los AGEs (59-45 % del BSA). Conclusiones: Los AGEs y el alendronato inhiben el número y diferenciación de Oc en cultivo, con un efecto aditivo entre ambos a altas concentraciones de alendronato. También reducen la expresión de RANKL en osteoblastos, lo cual podría explicar parcialmente sus efectos sobre el reclutamiento y la maduración de Oc. Los AGEs y bajas dosis de alendronato aumentan la expresión de RAGE en Oc.Introduction: Patients with Diabetes mellitus frequently show osteopenia and/or osteoporosis, as well as an increase in low-trauma fracture risk. This has been postulated to be caused partially by the accumulation of advanced glycation endproducts (AGEs) in bone extracellular matrix. AGEs could affect the homeostasis of bone cells, such as osteoblasts, osteocytes and osteoclasts. Osteoclasts (Oc) are multi-nucleated cells specialized in resorbing bone. Bisphosphonates (BP) are drugs widely used for treatment of bone diseases, and their principal mechanism of action is to inhibit the resorptive action of Oc. However, the use of BP for the treatment of patients with Diabetes-related bone disease is still controversial. Objective: To study the effect of AGEs and Alendronate (an N-containing BP) on the development of Oc in culture, as well as possible mechanisms of action involved in these effects. Materials and Methods: RAW264.7 macrophages and UMR106 osteoblasts were co-cultured for 8 days, with BSA or AGEs (50-200 μg/ml), with or without Alendronate (10-8–10-4M). The effect of these culture conditions on Oc formation was evaluated (number of Oc, cell-associated tartrate-resistant acid phosphatase [TRAP] activity), as well as Oc expression of RAGE (receptor for AGEs), and osteoblastic expression of RANK ligand (RANKL). These last two parameters were evaluated by indirect immunofluorescence, in order to estimate the expression and sub-cellular distribution of both membrane-associated proteins. Results: AGEs (50-200 μg/ml) dose-dependently inhibited TRAP activity (10-30 %) and the number of multinucleated Oc (55 %). Similar results were observed for low doses of Alendronate (10-8M–10-6M). The co-incubation of low doses of Alendronate with 100 mg/ml of AGEs, did not induce an additional inhibition of TRAP activity or Oc number, to that observed for AGEs alone. High levels of Alendronate (10-5M–10-4M) inhibited Oc TRAP activity (20-25 % inhibition versus BSA, and 17 % versus AGEs), and also decreased the number of Oc formed in the presence of AGEs (16 % inhibition versus AGEs). Oc incubated in the presence of 100 μg/ml AGEs, showed a significant increase in the expression of RAGE (152 % versus BSA). Similar results were found after incubating with 10-8M Alendronate (130 % versus BSA). On the contrary, high doses of Alendronate (10-5M) did not affect the expression of RAGE in co-cultures incubated with BSA (95 % versus BSA). On the other hand, low doses of Alendronate in the presence of AGEs, did not affect the up-regulation of RAGE induced by AGEs (145 % versus BSA). However, when the Oc were co-incubated with AGEs and 10-5M Alendronate, this dose of BP was able to block the stimulation of RAGE expression induced by AGEs (105 % versus BSA). In osteoblasts, incubation with 100 μg/ml AGEs induced an inhibition in the expression of RANKL (50 % versus BSA). Alendronate (10-8M-10-5M) also inhibited RANKL expression in a dose-dependent manner (65-47 % versus BSA). However, Alendronate (10-8M–10-5M) did not modify the AGEs-induced inhibition in osteoblastic RANKL expression (59-45 % versus BSA). Conclusions: AGEs and Alendronate inhibit the number and differentiation of Oc in culture, with an additive effect for both agents at high Alendronate concentrations. AGEs and Alendronate also reduce the osteoblastic expression of RANKL, which could partially explain their effects on the recruitment and maturation of Oc. In addition, AGEs and low doses of Alendronate increase the expression of RAGE in cultured Oc, and this effect correlates with their inhibition of Oc development.Laboratorio de Investigación en Osteopatías y Metabolismo Minera

Ácidos orgánicos producidos por la fermentación in vitro de kefiran por bacterias intestinales de origen humano

La fibra no digerible contenida en algunos alimentos como frutas y verduras, tiene la capacidad de llegar al colon donde es fermentada por las poblaciones de bacterias residentes. Algunos polisacáridos producidos por bacterias lácticas también cumplen con esta condición. Uno de los mayores productos metabólicos de esta fermentación son ácidos orgánicos de cadena corta, los cuales otorgan diversos beneficios al consumidor. Un modelo para estudiar el perfil de ácidos producidos es la fermentación in vitro utilizando como inóculo materia fecal de origen humano. El objetivo del presente trabajo fue comparar los perfiles de ácidos orgánicos obtenidos como producto de la fermentación de kefiran, un glucogalactano producido por bacterias lácticas, por la microbiota intestinal humana. Se utilizaron muestras provenientes de 10 niños sanos entre 12 y 36 meses de edad. Las muestras fueron entregadas con consentimiento informado y utilizadas dentro de las 2 hs después de la deposición. También se entregó una encuesta con datos relevantes como: tipo de nacimiento (parto natural o cesárea), tipo de leche (materna o de fórmula) y dieta, entre otros. Para realizar las fermentaciones, se formuló un medio de cultivo basal, al cual se le adicionaron 300 mg/L de kefiran. Se colocó la materia fecal y se incubó en condiciones de anaerobiosis a 37° C durante 0, 24, 48 y 72 hs. Transcurrido ese tiempo, los sobrenadantes fueron analizados por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para la identificación y cuantificación de ácidos acético, propiónico y butírico. Se utilizó una columna de exclusión molecular Aminex HPX-87H (Biorad) asociada a un detector UV (Waters, Milford). De todas las muestras de materia fecal analizadas, se encontró que el ácido mayoritario fue el acético (1 a 3 mM), triplicando en concentración a los otros ácidos analizados, lo cual está en concordancia con datos bibliográficos. Por otro lado, no se encontraron todos los ácidos en todas las muestras, lo cual indica una heterogeneidad inicial en el perfil de ácidos que se encuentra en la última porción del colon de cada individuo. Luego de 24 hs de fermentación, se observó un incremento estadísticamente significativo del ácido acético en todas las muestras analizadas (11 a 21 mM); seguido por el ácido butírico (3 a 8 mM) y el ácido propiónico (2 a 7 mM). Luego de 48 hs de fermentación, se encontró una alta concentración de ácido propiónico en la mayoría de las muestras analizadas (20 a 25 mM) seguido de una pequeña cantidad de los otros ácidos analizados. A las 72 hs de fermentación, se encontró un incremento del ácido acético (9 a 22 mM), seguido por ácido butírico (5 mM) y propiónico (2 a 5 mM). De este modo, se puede concluir que este polisacárido prebiótico es utilizado por la microbiota intestinal produciendo ácidos grasos de cadena corta, con potencial efecto modulador a nivel de la mucosa intestinal.Fil: Medrano, Micaela. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comisión de Investigaciones Científicas. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos; ArgentinaFil: Simonelli, Nicolás. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comisión de Investigaciones Científicas. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos; ArgentinaFil: Gangoiti, María Virginia. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Departamento de Ciencias Biológicas. Laboratorio de Investigación en Osteospatías y Metabolismo Mineral; ArgentinaFil: Abraham, Analia Graciela. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comisión de Investigaciones Científicas. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos; ArgentinaXXI Congreso Latinoamericano y del Caribe de Ciencia y Tecnología de Alimentos y XVII Congreso Argentino de Ciencia y Tecnología de AlimentosBuenos AiresArgentinaAsociación Argentina de Tecnólogos AlimentariosAsociación Latinoamericana y del Caribe de Ciencia y Tecnología de Alimento

Effect of metformin on bone marrow progenitor cell differentiation: In vivo and in vitro studies

Diabetes mellitus is associated with bone loss. Patients with type 2 diabetes are frequently treated with oral antidiabetic drugs such as sulfonylureas, biguanides, and thiazolidinediones. Rosiglitazone treatment has been shown to increase adipogenesis in bone marrow and to induce bone loss. In this study we evaluated the effect of in vivo and in vitro treatment with metformin on bone marrow progenitor cells (BMPCs), as well as the involvement of AMPK pathway in its effects. The in vitro effect of coincubation with metformin and rosiglitazone on the adipogenic differentiation of BMPCs also was studied. In addition, we evaluated the effect of in vivo metformin treatment on bone regeneration in a model of parietal lesions in nondiabetic and streptozotocin-induced diabetic rats. We found that metformin administration both in vivo and in vitro caused an increase in alkaline phosphatase activity, type I collagen synthesis, osteocalcin expression, and extracellular calcium deposition of BMPCs. Moreover, metformin significantly activated AMPK in undifferentiated BMPCs. In vivo, metformin administration enhanced the expression of osteoblast-specific transcription factor Runx2/Cbfa1 and activation of AMPK in a time-dependent manner. Metformin treatment also stimulated bone lesion regeneration in control and diabetic rats. In vitro, metformin partially inhibited the adipogenic actions of rosiglitazone on BMPCs. In conclusion, our results indicate that metformin causes an osteogenic effect both in vivo and in vitro, possibly mediated by Runx2/Cbfa1 and AMPK activation, suggesting a possible action of metformin in a shift toward the osteoblastic differentiation of BMPCs.Facultad de Ciencias Exacta

Biological activity of kefir polysaccharide (kefiran) in the intestinal context and its effect on consumer health

El interés por el consumo de alimentos saludables y poco procesados ha crecido en los últimos años. Al mismo tiempo, también se ha incrementado la evidencia científica que afirma que una población bacteriana intestinal saludable es responsable de la buena salud. Dentro de los alimentos que favorecen el desarrollo de un microbiota intestinal saludable están los polisacáridos no digeribles y dentro de estos, los exopolisacáridos bacterianos. En este artículo de revisión se aborda el estudio del polisacárido kefiran, presente en la leche fermentada artesanal denominada kéfir. El mecanismo de acción de este polisacárido y su acción benéfica para la salud podrían explicarse a través de tres mecanismos que actuarían solos o de manera sinérgica: i) interacción directa del polímero con las células intestinales; ii) estimulación de poblaciones bacterianas benéficas y producción de metabolitos con actividad biológica); y/o iii) modulación del sistema inmune y respuesta sistémica. Se desarrollan los tres mecanismos haciendo un recorrido por la evidencia científica que los sustenta. Teniendo en cuenta la gran cantidad de efectos biológicos demostrados, así como la versatilidad que tiene este biopolímero para mejorar las características funcionales de los alimentos, se concluye que el kefiran tiene gran potencialidad para ser utilizado como aditivo alimentario. Por otro lado, el consumo de la leche fermentada kefir producida artesanalmente en los hogares es una fuente natural de este polisacárido.Interest in healthy and under processed foods has grown in recent years; and so did scientific evidence showing that a healthy gut microbiota is responsible for good health. Among the foods that promote the development of a healthy gut microbiota are non-digestible polysaccharides and within them, bacterial exopolysaccharides. This review article discusses the health benefits of kefiran, the bacterial exopolysaccharide present in artisanal fermented milk called kefir. e mechanism of action of this polysaccharide and its beneficial action for health could be explained through three mechanisms that would act alone or synergistically: (i) direct interaction of the biopolymer with intestinal cells; (ii) stimulation of beneficial bacterial populations and production of metabolites with biological activity; and/or (iii) modulation of the immune system and systemic response. All three mechanisms are developed by taking a tour of the scientific evidence that underpins them. Considering the large number of proven biological effects, as well as the versatility that this biopolymer has to improve the functional characteristics of food, it can be concluded that kefiran has great potential to be used as a food additive. On the other hand, the consumption of kefir-fermented milk produced in households is a natural source of this biopolymer at appropriate doses.Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de AlimentosLaboratorio de Investigación en Osteopatías y Metabolismo Minera