Participation of sulfated glycosaminoglycans in critical moments of the post-ejaculation life of the spermatozoon : human and murine mouse model

El espermatozoide humano transita por diferentes estadios desde que es formado en el testículo: madura en el epidídimo, es eyaculado e ingresa dentro del tracto reproductor femenino donde ocurrirá el proceso de capacitación espermática. El Heparán Sulfato (HS) es una molécula que se encuentra presente en el humano tanto en el complejo cumulus-oocito(COC) como en el espermatozoide y, por su parte, el espermatozoide contiene receptores para heparina (análogo funcional y estructural del HS). También está presente en el fluido folicular y en el fluido oviductal/trompas de Falopio, donde podría participar en la regulación de la interacción espermatozoide-oviducto/trompas de Falopio. Esta distribución ubicua del HS plantea, por un lado, la posible colaboración de ambos gametos en el proceso de descondensación espermática in vivo y, por otro, la posible participación del HS en otras etapas del proceso reproductivo. Varios glicosaminoglicanos fueron encontrados como mediadores de la interacción entre el espermatozoide y las células oviductales/tracto reproductor femenino en la formación del “reservorio funcional”; la unión de espermatozoides al epitelio oviductal o del tracto reproductor femenino, es mediada por reconocimiento de carbohidratos en numerosas especies. Por esto, nos pareció interesante explorar el rol que cumple el HS y sus receptores en el espermatozoide o en las células del tracto reproductor femenino en la funcionalidad espermática a lo largo de su pasaje por el mismo. Teniendo en cuenta los cambios que suceden en el espermatozoide a lo largo de su vida post-eyaculación, nos planteamos los siguientes objetivos para esta tesis doctoral: (1)Evaluar la localización del HS en la superficie de espermatozoides lavados, incubados en condiciones capacitantes o habiendo sufrido reacción acrosomal inducida; (2) caracterizar la interacción entre las célulasepiteliales del tracto reproductor femenino humano y espermatozoides humanos, mediada por HS y sus receptores; (3) evaluar el posible rol biológico del HS espermático en el proceso de descondensación nuclear in vitro; (4) correlacionar el proceso de descondensación nuclear del espermatozoide humano in vitro con lo observado en la clínica a través de los procedimientos de fecundación asistida. A la luz de los resultados obtenidos, podemos concluir que (1)el porcentaje de espermatozoides humanos que poseen HS en su membrana plasmática disminuye a medida que el mismo transita por los diferentes estadios post-eyaculación. Esto podría estar reflejando que el HS es una molécula fundamental en el proceso de selección de espermatozoides a lo largo del tracto reproductivo femenino. Sin embargo, la presencia de HS en la superficie del espermatozoide humano no está relacionada con el estado de reacción (o exocitosis) acrosomal. Por otra parte, observamos que el HS se encuentra también en la superficie de los espermatozoides de ratón, precisamente en el segmento ecuatorial, independientemente del estado de exocitosis acrosomal en que se encuentre el mismo. Al analizar la interacción entre el espermatozoide humano y diferentes tipos celulares provenientes del tracto reproductor femenino humano in vitro, podemos decir que (2)tanto elHS como su receptor, presentes en el espermatozoide y en las células del endometrio y de la trompa de Falopio, estarían involucrados en la interacción entre estos tipos celulares. Además, confirmamos (3)que el HS del espermatozoide humano no está implicado en la descondensación nuclear y que podría estar involucrado en otros procesos como la fusión con el oocito, siendo el HS oocitario el único responsable de la descondensación. A lo largo de la remodelación de la cromatina espermática, diferentes factores pueden inducir daño en su DNA, como así también alteraciones en la condensación de la cromatina, que han sido asociados a infertilidad masculina. Utilizando dos técnicas que evalúan la funcionalidad del núcleo espermático, como lo son el TUNEL y el ensayo de descondensación fisiológica in vitro, descripto en el laboratorio, (4)pudimos clasificar a los pacientes infértiles como descondensadores rápidos o lentos y concluimos que los descondensadores lentos tendrían mayor posibilidad de éxito en fecundación asistida (ICSI) si son TUNEL negativos o si utilizan ovodonación. De este modo, la evaluación de la velocidad de descondensación, sumada a otros parámetros de funcionalidad espermática, podría ser una herramienta útil en la toma de decisiones terapéuticas en fecundación asistida.Human spermatozoa go through different stages since their formation in the testis: maturation in the epididymis, ejaculation and entry into the female tract where the sperm capacitation process will occur. Heparan Sulfate (HS) is a sulfated glycosaminogly can present both in the humancumulus-oocyte complex (COC) and in spermatozoa. Also, spermatozoa contain receptors for heparin (functional and structural analogue of HS). In addition, HS is found in follicular and oviductal fluids, where it could participate in the regulation of sperm-oviduct interaction. HS has also been studied as a mediator of very specific ligand-receptor interactions (FGF, HIV, HPV, among others). This ubiquitous distribution of HS raises the possibility that both gametes collaborate inthe process of sperm decondensation in vivo and the possible participation of HS in other stages of the reproductive process. Several glycosaminoglycans were found to be mediators of the interaction between sperm and oviductal cells in the formation of a "functional sperm reservoir”and the binding of sperm to the oviductal epithelium is mediated by carbohydrate recognition in numerous species. Therefore, we found it interesting to explore the role of HS and HS receptors of spermatozoa and endometrial or oviductal epithelial cells, on sperm function during the transit through the female reproductive tract. Taking into aCOCunt the changes undergone by the spermatozoon following ejaculation, its journey through the female reproductive tract and our laboratory ́s expertise in glycosaminoglycan biochemistry, we proposed the following objectives for this thesis: (1) to evaluate the location of HS on the sperm surface in washed spermatozoa, spermatozoa incubated under capacitating conditions and acrosome reacted spermatozoa; (2) to characterize the interaction between human female tract epithelial cells and human spermatozoa, mediated by HS and its receptors; (3)to evaluate the possible role of sperm borne HS in the process of in vitronuclear decondensation; (4) to correlate human sperm in vitro decondensation with assisted reproduction success in a clinical setting. In the light of the results obtained, we can conclude that (1) the percentage of human spermatozoa with membrane bound HS decreases as sperm proceed along the different post-ejaculatory stages. This could be implying that HS plays a fundamental role in the process of sperm selection throughout the female reproductive tract. The presence of HS on the surface of human sperm is not related to acrosomal status. Similarly, HS is present on the surface of mouse sperm, precisely on the equatorial segment, regardless of acrosomal status. Analysis of the interaction between human sperm and different epithelial cell types of the humanfemale tract in vitro, suggests that (2)the HSand itsreceptor, present in both spermatozoa and endometrial and Fallopian tube cellscould be involved in the interactionbetween these cell types. We confirmed that (3) sperm borne HS is not involved in nuclear decondensation and that oocyte HS is solely responsible for this process,but thatit could be involved in other processes such as sperm oocyte fusion. Throughout sperm chromatin remodeling, several factors can damage sperm DNA or alter chromatin condensation, and both have been associated to male infertility. Using two techniques that evaluate sperm nuclear function, such as TUNEL and the human sperm in vitrodecondensation assay described in our laboratory, (4)we were able to classify infertile patients as slow or fast decondensers and conclude that slowdecondensers would have a greater chance of success in assisted reproduction (ICSI) if they are TUNEL negative or if they use donor oocytes. Thus, the evaluation of sperm decondensation velocity, taken together with other parameters of sperm function, could be a useful tool to aid decision making in assisted reproduction.Fil: Galotto, Camila. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

Murine sperm capacitation, oocyte penetration and decondensation following moderate alcohol intake

Male chronic alcohol abuse causes testicular failure and infertility. We analyzed the effects of moderate sub-chronic alcohol intake on sperm morphology, capacitation, fertilization and sperm head decondensation. CF-1 male mice were administered 15% ethanol in drinking water for 15 days; control mice received ethanol-free water. Similar patterns of tyrosine phosphorylation were observed in capacitated spermatozoa of control and treated males. Percentage of hyperactivation (H) and spontaneous (SAR) and progesterone-induced (IAR) acrosome reaction significantly decreased at 120 and 150min of capacitation in treated males compared to controls (H: 14.1±2.5 vs 23.7±2.6, P<0.05; SAR-T120min: 17.9±2.5 vs 32.9±4.1, P<0.01; IAR-150min: 43.3±3.5 vs 73.1±1.1, P<0.001, n=6). During in vitro fertilization (2.5, 3.5 and 4.5h post-insemination), there was an increased percentage of fertilized oocytes (with a decondensed sperm head and one or two pronuclei) in treated males (P<0.001, n=7). After 60min of in vitro decondensation with glutathione plus heparin, the percentage of decondensed sperm heads was significantly higher in treated males than in controls (mean±s.d.: 57.1±5.6 vs 48.3±4.5, P<0.05, n=5). The percentage of morphologically normal sperm heads was significantly decreased in treated males with respect to controls (P<0.001, n=9). These results show that short-term moderate alcohol consumption in outbred mice affect sperm morphology, hyperactivation, acrosomal exocytosis, and the dynamics of in vitro fertilization and in vitro sperm nuclear decondensation.Fil: Sanchez, Melisa Celeste. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Fontana, Vanina Andrea. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Biológica; ArgentinaFil: Galotto, Camila. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Cambiasso, Maite Yael. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Sobarzo, Cristian Marcelo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones Biomédicas. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones Biomédicas; ArgentinaFil: Calvo, Lucrecia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Calvo, Juan Carlos. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Biológica; ArgentinaFil: Cebral, Elisa. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Biodiversidad y Biología Experimental y Aplicada. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Biodiversidad y Biología Experimental y Aplicada; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentin

El espermatozoide: algo más que un paquete de lujo para entregar DNA

Durante la formación del espermatozoide, en la última etapa de la espermatogénesis, llamada espermiogénesis, hay un recambio de histonas por protaminas (P1 y P2). Estas proteínas básicas empaquetan la cromatina modificando los nucleosomas por estructuras de toroides. Esto significa una condensación mucho mayor que la de una célula somática, haciendo esta cromatina transcripcionalmente inactiva, pero mucho más resistente a daños físicos y por especies reactivas de oxígeno. Luego de la penetración del espermatozoide al ovocito, el primer paso hacia la formación del pronúcleo masculino es la descondensación de esta cromatina. Este proceso se lleva a cabo con la acción del glutatión que reduce los puentes disulfuro intra e inter protaminas, como también de una molécula con alta carga negativa que permite el remplazo de las protaminas por las histonas ovocitarias. Hemos estudiado este proceso y demostrado que esa molécula es el heparán sulfato ovocitario. También estudiamos el papel de otro glicosaminoglicano con cierta capacidad descondensante, el dermatán sulfato, en espermatozoides de donantes y pacientes, en particular con respecto a la proporción de protaminas presentes en esos núcleos, demostrando una relación P1/P2 disminuida y con posibilidad de impactar en la descondensación diferencial usando dermatán sulfato o heparina (como equivalente molecular del heparán sulfato, por similitud de estructura, carga y potencia descondensante).Fil: Cambiasso, Maite Yael. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Galotto, Camila. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Sanchez , María Celeste. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Fontana, Vanina Andrea. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Biológica; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Piñeiro, Lucrecia. Universidad Favaloro. Facultad de Medicina; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Romanato, Marina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Calvo, Juan Carlos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Biológica; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; Argentin

Human sperm decondensation in vitro is related to cleavage rate and embryo quality in IVF

Purpose: To investigate whether the ability of human spermatozoa to decondense in vitro in the presence of heparin (Hep) and glutathione (GSH) is related to assisted reproduction (ART) success. Methods: Cross-sectional pilot study involving male partners of 129 infertile couples undergoing ICSI with (45) or without (84) donor oocytes at two infertility clinics in CABA, Argentina, between October 2012 and December 2013. In vitro decondensation kinetics with Hep and GSH and DNA fragmentation (TUNEL) were determined on the same sample used for ICSI. The possible relationship of decondensation parameters (maximum decondensation and decondensation velocity) and TUNEL values with ART success was evaluated. Results: Embryo quality correlated positively with decondensation velocity (D60/D30) (Spearman?s correlation, p < 0.05). According to D60/D30 values, patients were classified as slow decondensers (SlowD) (n = 68) or fast decondensers (FastD) (n = 61). Embryo quality was better in FastD (unpaired t test, p < 0.05). FastD and SlowD were subdivided according to use of donor oocytes. Among SlowD, biochemical and clinical pregnancy rates per transfer were significantly higher in donor (n = 19) vs. in non-donor (n = 31) cycles (Fisher?s exact test, p < 0.05). TUNEL values were not related to embryo quality, but no clinical pregnancies or live births were achieved in TUNEL+ SlowD (n = 7). Conclusion: Decondensation kinetics of human spermatozoa in vitro with Hep and GSH could be related to embryo quality and ART success.Fil: Galotto, Camila. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Cambiasso, Maite Yael. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Julianelli, Vanina Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; Argentina. Procrearte; ArgentinaFil: Rey Valzacchi, Gaston Javier. Procrearte; Argentina. Hospital Italiano; ArgentinaFil: Rolando, R. N.. Hospital Italiano; ArgentinaFil: Rodriguez, M. L.. Hospital Italiano; ArgentinaFil: Calvo, L.. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Calvo, Juan Carlos. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; Argentina. Universidad de Buenos Aires; ArgentinaFil: Romanato, Marina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental. Fundación de Instituto de Biología y Medicina Experimental. Instituto de Biología y Medicina Experimental; Argentin