Preparación de nanosistemas por autoensamblaje de ciclodextrinas y calixarenos. Aplicaciones al transporte y a la liberación controlada de genes y fármacos

Texto completo descargado desde TeseoEn esta Tesis hemos diseñado entidades moleculares basadas en derivados de beta-ciclodextrina y calix[4]areno capaces de formar nanosistemas autoensamblados para su aplicación al transporte y la liberación controladas de fármacos y material génico. Para ello se han ensayado dos estrategias complementarias: la incorporación de elementos estructurales que promuevan la auto-organización mediante métodos de funcionalización selectiva y la formación de complejos supramoleculares que pre-organizan las unidades moleculares y favorecen la formación de nanopartículas, bien de manera espontánea, bien en presencia de un ácido nucleico. La aproximación basada en el uso de prototipos monodispersos permite realizar estudios de relación entre estructura molecular-propiedades de los nanosistemas autoensamblados-eficacia como transportadores de genes y fármacos. Además, los nanocomplejos resultantes son susceptibles de modificación en la superficie con elementos de biorreconocimiento para su vectorización a receptores celulares específicos. - Sistemas auto-ensamblados para la liberación dirigida de fármacos. El éxito en la administración de agentes terapéuticos se basa en el desarrollo de sistemas de encapsulación y liberación de principios activos que sean capaces de mejorar la biodisponibilidad de fármacos insolubles o biodegradables, así como de evitar efectos secundarios mediante el transporte dirigido a receptores celulares específicos. Las ciclodextrinas (CDs) son oligosacáridos cíclicos que tienen la propiedad de complejar moléculas hidrofóbicas en su cavidad y solubilizarlas en medio acuoso, lo que ha sido extensamente empleado en la industria farmacéutica. El diseño basado en la formación de complejos de inclusión presenta dos limitaciones: sólo las moléculas adapatadas al tamaño de la cavidad pueden ser encapsuladas, y la estequiometría está limitada a una relación huésped-anfitrión 1:1. Además, las CDs nativas no son transportadores ideales ya que carecen de propiedades de vectorización hacia receptores biológicos. El desarollo de nanoestructuras funcionales, con capacidad de auto-ensamblarse en condiciones diluídas en agua o en medio acuoso tamponado, representa una interesante alternativa para la construcción de sistemas de liberación de fármacos más versátiles. La estrategia implica la creación de nuevas nanocavidades hidrofóbicas que tengan la posibilidad de encapsular una mayor cantidad de moléculas sin limitaciones de tamaño de las mismas. Los derivados de calixa[4]areno (CA) y de beta--ciclodextrina (beta-CD) son plataformas privilegiadas para esta finalidad debido a su capacidad de formar superestructuras huésped-anfitrión. Así mismo, tienen la posibilidad de ser funcionalizadas para promover su pre-organización controlada a través de interacciones no covalentes. Por ello, hemos desarrollado una síntesis muy eficiente para preparar heterodímeros anfifílicos neutros de CA- beta-CD que son capaces de auto-organizarse en agua para dar nanopartículas. Estas nanopartículas presentan un núcleo interno formado por unidades hidrofóbicas de CA y una capa externa constituida por unidades hidrofílicas de CDs. Los fragmentos de CA promueven el empaquetamiento compacto de cadenas grasas instaladas en la cara inferior del macrociclo en conformación de cono, proporcionando una matriz lipídica donde pueden ser encapsuladas las moléculas hidrofóbicas del fármaco. Por otra parte, las unidades de beta-CD de la superficie de la nanopartícula permite la solubilización del sistema en agua así como la incorporación de ligandos mediante la formación de complejos de inclusión. La capacidad de estos sistemas para encapsular y dar lugar a una liberación controlada de diazepam y docetaxel, así como de ser post-modificados supramolecularmente con glicoligandos derivados de adamantano que reconocen al receptor de manosa de macrófagos humanos, ilustra el potencial que tienen estos nuevos sistemas en nanomedicina. Para optimizar las propiedades de bio-reconocimiento de los glicoligandos empleados en la liberación dirigida de fármacos, se ha llevado a cabo un estudio sobre las bases moleculares del efecto multivalente observado en las interacciones carbohidrato-lectina. Para ello, se han preparado una serie de multigalactósidos con valencias entre una y siete, con diferentes longitudes de espaciador. La afinidad de unión a lectinas de los multímeros, evaluada mediante ensayos ELLA (Enzyme-linked Lectin Assay) usando la lectina de cacahuete PNA (Peanut Agglutinin), fue dependiente de la longitud del espaciador. El efecto multivalente observado en los galactósidos con los espaciadores más largos fue explicado por su capacidad para entrecruzar la lectina PNA, tal y como indicaron los experimentos ELLA tipo sándwich y los ensayos de dispersión dinámica de la luz (DLS). EL mayor efecto multivalente mostrado por los galactósidos de espaciadores más cortos fue estudiado por microscopía de fuerza atómica (AFM), que demostró que el responsable de este comportamiento es un mecanismo de unión y re-captura de los ligandos en los sitios activos de la lectina. - Sistemas auto-ensamblados para terapia génica. La terapia génica es una estrategia prometedora para el tratamiento de una amplia gama de enfermedades. El objetivo terapéutico es introducir ADN en una célula para expresar o suprimir la expresión de una proteína determinada. Sin embargo, el ADN libre presenta baja permeabilidad de la membrana plasmática e inestabilidad metabólica, por lo que resulta imprescindible el desarrollo de vectores de genes capaces de compactar y proteger el material génico. A pesar de las propiedades superiores que presentan los sistemas transfección basados en vectores virales, los problemas de bioseguridad asociados han llevado al desarrollo de vectores no virales. La mayoría de los vectores sintéticos recogidos en la literatura se basan en sistemas poliméricos cuya naturaleza dispersa representa una desventaja importante para los estudios y aplicaciones fundamentales. Como alternativa, hemos desarrollado moléculas monodispersas capaces de auto-ensamblarse para complejar, condensar y proteger el ADN y la liberarlo en las células. Se han desarrollado métodos de funcionalización selectiva para preparar vectores sintéticos con anfifilicidad facial, que tienen dominios policatiónicos capaces de dar múltiples interacciones con los grupos fosfato de los nucleótidos y grupos funcionales hidrófobos que les proporcionan propiedades de autoensamblado para la condensación y la liberación controlada de material génico. Con estos fines hemos utilizado las plataformas de ciclodextrinas y de calix[4]arenos. Se ha diseñado una primera generación de sistemas transportadores de genes no virales auto-ensamblados mediante la instalación de un grupo xilileno en la cara secundaria de CDs policatiónicas. Los derivados de CDs xililenadas son capaces de auto-ensamblarse en agua para producir dímeros donde las interacciones hidrofóbicas son las fuerzas impulsoras. Se han empleado técnicas de fluorescencia, mecánica y dinámica molecular para estudiar la formación de complejos de 2-naftalencarboxilato de metilo (2MN), una sonda fluorescente, con ciclodextrinas neutras xililenadas que tienen la capacidad de dimerizar. La influencia del motivo de xilileno se evaluó mediante la comparación de los datos de complejación de 2MN por derivados xililenados con los obtenidos por sus homólogos no xililenados. Este estudio preliminar se llevó a cabo para entender mejor las bases moleculares de los procesos de formación de complejos de derivados de CD xililenadas con otros huéspedes, como fármacos o material génico, cuando están implicados procesos de asociación que compiten con los equilibrios de complejación. Cuando se incorporó el fragmento de xilileno en ciclodextrinas policatiónicas, el anillo aromático fue capaz de promover un proceso de dimerización supramolecular dependiente del pH, tal y como demostraron los experimentos de fluorescencia, RMN y dicroísmo circular. La capacidad de los dímeros de condensar ADN de manera reversible para formar nanocomplejos fue confirmada por microscopía de transmisión electrónica (TEM). Tal estrategia de preorganización facilita el auto-ensamblaje de los dímeros en presencia de ADN para formar complejos a un pH neutro. La acidificación desestabiliza los dímeros y, en consecuencia, el conjunto supramolecular de CD-ADN. El carácter dinámico y reversible de las interacciones en juego permite tanto la condensación como la liberación del material génico en la célula. La mayor eficiencia de transfección en células COS-7 exhibida por los derivados xililenados en comparación con sus homólogos permetilados, sugieren que la liberación de ADN en el citoplasma podría estar favorecido por el aumento de la acidez en los endosomas. Una segunda estrategia para proporcionar ciclodextrinas con capacidad de auto-ensamblaje se basa en el diseño de sistemas ternarios consistentes en complejos de inclusion, con estequiometría 2:1, de derivados de bis-adamantano y de cisteaminil- beta-CD. La alta afinidad del fragmento de adamantano por la cavidad de CD permite el anclaje supramolecular a dos unidades CD policatiónicas, por lo que no es necesaria la funcionalización de la cara secundaria de la CD con cadenas lipofílicas para promover la auto-asociación, lo que simplifica el número de etapas sintéticas. La termodinámica de los complejos se ha estudiado mediante RMN, valoración por calorimetría isotérmica (ITC) y cálculos computacionales. Los sistemas supramoleculares complejan el ADN para dar nanopartículas esféricas y homogéneas que protegen el material génico de la degradación por nucleasas. La transfección de células COS-7 y HepG2 confirmó la superioridad de los complejos ternarios respecto la CD policatiónica no anfifílica. Su capacidad de liberación de genes fue superior incluso que la del vector policatiónico polietilenimina, y los niveles de toxicidad fueron despreciables. Se preparó una tercera generación de vectores sintéticos auto-ensamblados mediante la instalación, sobre plataformas de beta-CD y CA, de dominios catiónicos y lipófilos separados Esto permitió el acceso a derivados anfifílicos policatiónicos capaces de auto-organizarse en presencia de ácidos nucleicos para dar nanocondensados en el que el material génico está completamente protegido del medio. Los grupos catiónicos interactúan con los nucleótidos mientras que las cadenas lipófilas ayudan a la compactación a través de interacciones hidrófobas. Imágenes de microscopía de transmisión electrónica revelaron una estructura consistente con un ordenamiento en el que se alternan las cadenas de ADN y bicapas anfifílicas de beta-CD o CA. En ambas series se confirmó la capacidad para formar nanocomplejos mediante microscopía AFM. La aplicación de metodologías de funcionalización química selectiva permite conservar la homogeneidad a nivel molecular, lo que ofrece oportunidades sin precedentes para los estudios de relación estructura-actividad. La incorporación de motivos de arginina se ha encontrado particularmente beneficioso en la serie de calix[4]arenos, mientras que una combinación de grupos amina y tiourea fue la mejor combinación para derivados de beta-CD. Los estudios de transfección in vitro en las líneas celulares de primate COS-7 y de rabdomiosarcoma humano, RD-4, permitió la identificación de candidatos óptimos para terapia génica. Por último, se ha diseñado una cuarta generación de vectores sintéticos basados en la estructura de surfactantes gemelos. Se han preparados dímeros policatiónicos anfifílicos de calix[4]areno covalentemente unidos por un espaciador. Se espera que estos compuestos presenten una mayor capacidad de transfección respecto a sus unidades de monómero correspondiente, como resultado de un efecto quelato y de una disminución de la concentración micelar crítica que dé lugar a una concentración bio-activa inferior a la de los monómeros constituyentes. Las metodologías de funcionalización selectivas utilizadas en la preparación de estos nuevos dímeros pueden ser extendidas para preparar nuevos surfactantes gemelos con el fin de optimizar las propiedades de transfección de los derivados monoméricos.Premio Extraordinario de Doctorado U

Generación, análisis y visualización de estructuras tridimensionales de complejos fármaco-diana para la docencia teórica y práctica del diseño de fármacos

Memoria ID-127. Ayudas de la Universidad de Salamanca para la innovación docente, curso 2019-2020

Application of ensemble pharmacophore-based virtual screening to the discovery of novel antimitotic tubulin inhibitors

Tubulin is a well-validated target for herbicides, fungicides, anti-parasitic, and anti-tumor drugs. Many of the non-cancer tubulin drugs bind to its colchicine site but no colchicine-site anticancer drug is available. The colchicine site is composed of three interconnected sub-pockets that fit their ligands and modify others’ preference, making the design of molecular hybrids (that bind to more than one sub-pocket) a difficult task. Taking advantage of the more than eighty published X-ray structures of tubulin in complex with ligands bound to the colchicine site, we generated an ensemble of pharmacophore representations that flexibly sample the interactional space between the ligands and target. We searched the ZINC data- base for scaffolds able to fit several of the subpockets, such as tetrazoles, sulfonamides and diaryl-methanes, selected roughly ~8000 compounds with favorable predicted properties. A Flexi-pharma virtual screening, based on ensemble pharmacophore, was performed by two different methodologies. Combining the scaffolds that best fit the ensemble pharmacophore-representation, we designed a new family of ligands, resulting in a novel tubulin modulator. We synthesized tetrazole 5 and tested it as a tubulin inhibitor in vitro. In good agreement with the design principles, it demonstrated micromolar activity against in vitro tubulin polymerization and nanomolar anti-proliferative effect against human epithelioid carcinoma HeLa cells through microtubule disruption, as shown by immunofluorescence confocal microscopy. The integrative methodology succedes in the design of new scaffolds for flexible pro- teins with structural coupling between pockets, thus expanding the way in which computational methods can be used as significant tools in the drug design process.The authors acknowledge the support of the Enlighten Your Research LatinAmerica2Europe (EYR-LA2EU) programme. I.L, R.O. and P.C. were also supported by MinCiencias, University of Antioquia, Ruta N, Colombia and the Max Planck Society, Germany. L.G-Y. and R.P-L. acknowledge the support by the Consejería de Educación de la Junta de Castilla y León (SA262P18 and SA116P20) and the Spanish Ministry of Science, Innovation and Universities (RTI2018-099474-BI00), co-funded by the EU’s European Regional Development Fund-FEDER. D.R. was supported by the CONICYT-PCI grant N° REDES190074 and FONDECYT grant N° 11180604. This work has been partially carried out on the ACME cluster, which is owned by CIEMAT and funded by the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness project CODEC2 (TIN2015-63562-R) with FEDER funds as well as supported by the CYTED co-founded RICAP Network (517RT0529)

Introducción de la gamificación en la docencia en Química en las facultades de Farmacia y de Ciencias Agrarias y Ambientales

Memoria ID-0196. Ayudas de la Universidad de Salamanca para la innovación docente, curso 2017-2018

The Masked Polar Group Incorporation (MPGI) Strategy in Drug Design: Effects of Nitrogen Substitutions on Combretastatin and Isocombretastatin Tubulin Inhibitors

[EN] Colchicine site ligands suffer from low aqueous solubility due to the highly hydrophobic nature of the binding site. A new strategy for increasing molecular polarity without exposing polar groups—termed masked polar group incorporation (MPGI)—was devised and applied to nitrogenated combretastatin analogues. Bulky ortho substituents to the pyridine nitrogen hinder it from the hydrophobic pocket while increasing molecular polarity. The resulting analogues show improved aqueous solubilities and highly potent antiproliferative activity against several cancer cell lines of different origin. The more potent compounds showed moderate tubulin polymerization inhibitory activity, arrested the cell cycle of treated cells at the G2/M phase, and subsequently caused apoptotic cell death represented by the cells gathered at the subG0/G1 population after 48 h of treatment. Annexin V/Propidium Iodide (PI) double-positive cells observed after 72 h confirmed the induction of apoptosis. Docking studies suggest binding at the colchicine site of tubulin in a similar way as combretastatin A4, with the polar groups masked by the vicinal substituents. These results validate the proposed strategy for the design of colchicine site ligands and open a new road to increasing the aqueous solubility of ligands binding in apolar environments

Elaboración de informes en formato de publicación científica

Memoria ID-0150. Ayudas de la Universidad de Salamanca para la innovación docente, curso 2017-2018

Aprendizaje basado en proyectos para el diseño de fármacos aplicado

Memoria ID-088 Ayudas de la Universidad de Salamanca para la innovación docente, curso 2020-2021

Docetaxel-Loaded Nanoparticles Assembled from β-Cyclodextrin/Calixarene Giant Surfactants: Physicochemical Properties and Cytotoxic Effect in Prostate Cancer and Glioblastoma Cells

Giant amphiphiles encompassing a hydrophilic β-cyclodextrin (βCD) component and a hydrophobic calix[4]arene (CA4) module undergo self-assembly in aqueous media to afford core-shell nanospheres or nanocapsules, depending on the nanoprecipitation protocol, with high docetaxel (DTX) loading capacity. The blank and loaded nanoparticles have been fully characterized by dynamic light scattering (DLS), ζ-potential measurements and cryo-transmission electron microscopy (cryo-TEM). The data are compatible with the distribution of the drug between the nanoparticle core and the shell, where it is probably anchored by inclusion of the DTX aromatic moieties in βCD cavities. Indeed, the release kinetics profiles evidenced an initial fast release of the drug, which likely accounts for the fraction hosted on the surface, followed by a slow and sustained release rate, corresponding to diffusion of DTX in the core, which can be finely tuned by modification of the giant amphiphile chemical structure. The ability of the docetaxel-loaded nanoparticles to induce cellular death in different prostate (human LnCap and PC3) and glioblastoma (human U87 and rat C6) cells was also explored. Giant amphiphile-based DTX formulations surpassing or matching the antitumoral activity of the free DTX formulation were identified in all cases with no need to employ any organic co-solvent, thus overcoming the DTX water solubility problems. Moreover, the presence of the βCD shell at the surface of the assemblies is intended to impart stealth properties against serum proteins while permitting nanoparticle surface decoration by supramolecular approaches, paving the way for a new generation of molecularly well-defined antitumoral drug delivery systems with improved specificity and efficiency. Altogether, the results provide a proof of concept of the suitability of the approach based on βCD-CA4 giant amphiphiles to access DTX carriers with tunable properties

Potent and Selective Benzothiazole-Based Antimitotics with Improved Water Solubility: Design, Synthesis, and Evaluation as Novel Anticancer Agents

The design of colchicine site ligands on tubulin has proven to be a successful strategy to develop potent antiproliferative drugs against cancer cells. However, the structural requirements of the binding site endow the ligands with low aqueous solubility. In this work, the benzothiazole scaffold is used to design, synthesize, and evaluate a new family of colchicine site ligands exhibiting high water solubility. The compounds exerted antiproliferative activity against several human cancer cell lines, due to tubulin polymerization inhibition, showing high selectivity toward cancer cells in comparison with non-tumoral HEK-293 cells, as evidenced by MTT and LDH assays. The most potent derivatives, containing a pyridine moiety and ethylurea or formamide functionalities, displayed IC50 values in the nanomolar range even in the difficult-to-treat glioblastoma cells. Flow cytometry experiments on HeLa, MCF7, and U87MG cells showed that they arrest the cell cycle at the G2/M phases at an early time point (24 h), followed by apoptotic cell death 72 h after the treatment. Tubulin binding was confirmed by microtubule network disruption observed via confocal microscopy. Docking studies support favorable interaction of the synthesized ligands at the colchicine binding site. These results validate the proposed strategy to develop potent anticancer colchicine ligands with improved water solubility

Glycoligand-targeted core-shell nanospheres with tunable drug release profiles from calixarene-cyclodextrin heterodimers

Stable core–shell nanospheres self-assemble in water from heterodimers combining a hydrophobic calix[4]arene moiety and a hydrophilic β-cyclodextrin head; their potential to encapsulate and provide sustained release of the anticancer drug docetaxel and undergo surface post-modification with glycoligands targeting the macrophage mannose receptor is discussed.Peer reviewe