Amiloride sensitive sodium channels (ENaC) and their regulation by proteases

El ENaC es un canal que permite el movimiento de Na+ desde el líquido luminal hacia las células en numerosos epitelios reabsortivos y también en otros tejidos como la placenta. ENaC juega un papel crucial en la homeostasis de los electrolitos y volumen de líquido extracelular. Es regulado por numerosas hormonas, incluyendo la aldosterona y bloqueado por el diurético amiloride. El ENaC está formado por tres subunidades homólogas α, β y γ que forman el poro por el cual se mueven los iones Na+. Dos factores regulan la actividad del ENaC. 1) el número de canales insertos en la membrana celular y 2) la probabilidad de apertura o tiempo en que se encuentra abierto el canal. El número de canales es el resultado de un balance entre su síntesis y degradación. La probabilidad de apertura depende de la proteólisis de zonas específicas de las subunidades α y γ por múltiples proteasas dentro de la célula y en el espacio extracelular. Entre las proteasas más estudiadas se encuentran la furina, prostasina, elastasa, plasmina y tripsina. Existen sustancias endógenas que bloquean la actividad de estas proteasas como la aprotinina, la bikunina y la nexina-1 y la expresión de las proteasas y sus inhibidores es regulada a su vez por la aldosterona, la tasa de movimiento de Na y el TFGβ. En este trabajo presentamos algunos ejemplos de esta regulación y su potencial papel en condiciones normales y en ciertas enfermedades como la fibrosis quística, renales e hipertensión.ENaC is a channel that mediates entry of Na+ from the luminal fluid into the cells in many reabsorbing epithelia and it is also expressed in human placenta. ENaC is crucial in the control of electrolyte and extracellular volume homeostasis. ENaC is regulated by several hormones, including aldosterone and blocked by amiloride and its analogs. ENaC channels are composed by three homologous subunits, α, β and γ that form the pore where Na ions are transported. Two factors regulate the activity of ENaC channels: 1) the number of channels inserted in the membrane and 2) the open probability of the channels or time that the channel is open. The number of channels is the result of a balance between the synthesis and degradation of ENaC channels. The open probability depends on the proteolysis of specific segments in the α and γ subunits of ENaC by multiple proteases inside of the cell or in the extracellular space. Among the most studied proteases are furin, prostasin, elastase, plasmin and trypsin. There are endogenous substances that block the activity of these proteases such as aprotinin, bikunin and nexin-1 and the expression of both, proteases and their inhibitors are controlled by the rate of Na+ movement, aldosterone and TFG-β levels. In this work we present some examples of this regulation and the potential role that this process may play under normal and pathological conditions such as cystic fibrosis, kidney diseases and hypertension.Fil: Galizia, Luciano. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones Médicas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Ojea, Alejandro. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones Médicas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Kotsias, Basilio Aristides. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones Médicas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentin

Lithium and its relation with the epithelial sodium channel and aquaporin-2

Desde hace más de cuarenta años que el litio es usado para el tratamiento de la enfermedad bipolar; recientes estudios sugieren también su utilidad en el trastorno cognitivo mínimo tipo amnésico. El litio es filtrado en el glomérulo y un 65-75% del mismo es reabsorbido en el túbulo contorneado proximal y en el asa ascendente de Henle por el transportador Na+, K+, 2Cl- y vía paracelular. Una pequeña fracción del litio entra en las células principales del túbulo colector por medio del canal epitelial de sodio sensible al amiloride (ENaC) localizado en la membrana apical de la célula. Luego de 10- 20 años de tratamiento con litio los enfermos pueden desarrollar poliuria, acidosis tubular e insuficiencia renal crónica que puede terminar en una forma de diabetes que no responde a la arginina vasopresina llamada diabetes insípida nefrogénica. Se cree que estas fallas renales son consecuencias de una reducción en el número de moléculas de acuaporina 2 en la membrana apical. Las causas para esto son complejas. El litio es un poderoso inhibidor de la isoforma beta de la enzima glicógeno sintetasa quinasa y esto está asociado a una menor actividad de la adenilato ciclasa que lleva a una disminución en la concentración intracelular de cAMP. Esto finalmente interferiría con la síntesis de nuevas moléculas de acuaporina 2 y con el tráfico de ellas desde la zona subapical de la célula hacia la membrana celular, causando la disminución en la reabsorción de agua en la parte distal del nefrón.For more than 40 years lithium has been used to treat bipolar disorder and recent trials suggest a potential efficacy also in the treatment of the amnestic mild cognitive impairment. Lithium is filtered by the glomerulus and 65% - 75% of the filtered amount is reabsorbed along the proximal tubule and in the thick ascending limb of Henle's loop by the Na+, K+, 2Cl- transporter and via paracellular. A small fraction of lithium is reabsorbed in the collecting duct's principal cells through the epithelial Na channel (ENaC) located on the apical side of the cells. Polyuria, renal tubular acidosis and chronic renal failure are the most frequent adverse effects of lithium after 10-20 years of treatment and these alterations can reach to a vasopressin nonresponding form of diabetes insipidus entity called nephrogenic diabetes insipidus. It is believed that the molecular mechanisms of these renal changes are related to a reduction in the number of aquaporin-2 inserted in the apical membrane of the cells. The causes of this are complex. Lithium is a powerful inhibitor of the enzyme glycogen synthase kinase 3β and this is associated with a lower activity of adenylate cyclase with a reduction in the cAMP levels inside of the cells. The latter may interfere with the synthesis of aquaporin-2 and also with the traffic of these molecules from the subapical site to membrane promoting the impairment of water reabsorption in the distal part of the kidney.Fil: Galizia, Luciano. Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas. Oficina de Coordinacion Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones Medicas; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones Médicas; ArgentinaFil: Marino, Gabriela Inés. Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas. Oficina de Coordinacion Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones Medicas; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones Médicas; ArgentinaFil: Kotsias, Basilio Aristides. Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas. Oficina de Coordinacion Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones Medicas; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones Médicas; Argentin

Cell volume regulation and aquaporins

In the recent years, the importance of the volume of a given cell has been accepted not only in defining its intracellular osmolality and its shape, but also in defining other cellular functions, such as transepithelial transport, cell migration, cell growth, cell death and the regulation of intracellular metabolism (35). Since most cells have to perform these physiological functions under a variable osmotic stress, cell volume must be carefully regulated. Based on the origin of the disturbance, cell volume changes are frequently classified into two categories: anisosmotic (alterations in extracellular solute concentration) and isosmotic (alterations in intracellular solute concentration) volume changes. Because of the relatively high permeability of the plasma membrane for water, any such gradient results in the immediate flow of water into or out of the cell causing cell swelling or shrinkage. To regulate cell volume, cells use channels and transport systems to flux osmolytes across the plasma membrane, followed by the obligatory movement of water. The current review reflects these developments and focuses on the contributions of aquaporins water channels in regulatory volume processes in a variety of cells.Sociedad Argentina de Fisiologí

Estudio del rol de la AQP2 en la regulación del volumen celular

La capacidad de las células para regular su volumen es esencial para el mantenimiento de la homeostasis celular en condiciones de anisotonia. Nosotros previamente informamos, en una línea celular que deriva de túbulo colector cortical de rata (RCCD_1), que la presencia de la acuaporina 2 (AQP2) en la membrana celular es crítica para la activación rápida de mecanismos de regulación de volumen luego de un shock hipotónico (RVD). El objetivo de este trabajo de tesis fue investigar la vía de señalización que relaciona la AQP2 con esta activación rápida de RVD. Probamos la hipótesis de que AQP2 podría tener un papel en la activación de la entrada de calcio por hipotonía e investigamos su importancia en la regulación del volumen celular. Para ello estudiamos la [Ca^2+]i y el volumen celular en respuesta a un shock hipotónico en células WT- RCCD1 (no expresan acuaporinas) y en células AQP2-RCCD_1 (transfectadas con AQP2). Encontramos, que luego de la exposición a un gradiente hipotónico, sólo en las células que expresan AQP2 se observa un sustancial aumento [Ca^2+]i. Este aumento de la [Ca^2+]i es fuertemente dependiente del calcio extracelular y de depósitos intracelulares. La exposición de las células AQP2-RCCD_11 a HgCl_2 (inhibidor de las acuaporinas), gadolinio y rojo de rutenio (inhibidores del TRPV4) redujeron el aumento [Ca^2+]i . Además, la exposición de las células a estos inhibidores disminuyó el rápido RVD. Estudios de inmunofluorescencia mostraron que, en condiciones de isotonía el TRPV4 se distribuye principalmente en el compartimento intracelular en ambas líneas celulares. Sin embargo en condiciones de hipotonía el TRPV4 es translocado a la membrana celular sólo en las células que expresan AQP2. En esta tesis proponemos la existencia de una asociación funcional entre la AQP2 y el TRPV4, esencial para la generación de señales de calcio inducidas por swelling y necesarias para la activación rápida de los mecanismos de regulación de volumen celular

Study of AQP2 role in cell volume regulation

La capacidad de las células para regular su volumen es esencial para el mantenimiento de la homeostasis celular en condiciones de anisotonia. Nosotros previamente informamos, en una línea celular que deriva de túbulo colector cortical de rata (RCCD_1), que la presencia de la acuaporina 2 (AQP2) en la membrana celular es crítica para la activación rápida de mecanismos de regulación de volumen luego de un shock hipotónico (RVD). El objetivo de este trabajo de tesis fue investigar la vía de señalización que relaciona la AQP2 con esta activación rápida de RVD. Probamos la hipótesis de que AQP2 podría tener un papel en la activación de la entrada de calcio por hipotonía e investigamos su importancia en la regulación del volumen celular. Para ello estudiamos la [Ca^2+]i y el volumen celular en respuesta a un shock hipotónico en células WT- RCCD1 (no expresan acuaporinas) y en células AQP2-RCCD_1 (transfectadas con AQP2). Encontramos, que luego de la exposición a un gradiente hipotónico, sólo en las células que expresan AQP2 se observa un sustancial aumento [Ca^2+]i. Este aumento de la [Ca^2+]i es fuertemente dependiente del calcio extracelular y de depósitos intracelulares. La exposición de las células AQP2-RCCD_11 a HgCl_2 (inhibidor de las acuaporinas), gadolinio y rojo de rutenio (inhibidores del TRPV4) redujeron el aumento [Ca^2+]i . Además, la exposición de las células a estos inhibidores disminuyó el rápido RVD. Estudios de inmunofluorescencia mostraron que, en condiciones de isotonía el TRPV4 se distribuye principalmente en el compartimento intracelular en ambas líneas celulares. Sin embargo en condiciones de hipotonía el TRPV4 es translocado a la membrana celular sólo en las células que expresan AQP2. En esta tesis proponemos la existencia de una asociación funcional entre la AQP2 y el TRPV4, esencial para la generación de señales de calcio inducidas por swelling y necesarias para la activación rápida de los mecanismos de regulación de volumen celular.The ability of cells to regulate their volume is essential for maintenance of cellular homeostasis under anisotonic environmental conditions. We previously reported in a rat cortical collecting duct cell line (RCCD_1) that the presence of aquaporin 2 (AQP2) in the cell membrane is critical for the rapid activation of regulatory volume decrease mechanisms (RVD). The aim of our present work was to investigate the signalling pathway that links AQP2 to this rapid RVD activation. We tested the hypothesis that AQP2 could have a role in activation of calcium entry by hypotonicity and its implication in cell volume regulation. We studied [Ca^2+]i and cell volume changes in response to a hypotonic shock in WT-RCCD1 (not expressing aquaporins) and in AQP2-RCCD_1 (transfected with AQP2) cells. We found that after a hypotonic shock only AQP2-RCCD_1 cells exhibit a substantial increase in [Ca^2+]i. This [Ca2+]i increase is strongly dependent on extracellular Ca^2+ and on intracellular stores. Exposure of AQP2- RCCD1 cells to HgCl_2 (aquaporin inhibitor), gadolinium and ruthenium red (TRPV4 inhibitors) reduced the increase in [Ca^2+]i. Furthermore, exposure of cells to all of the above described conditions impaired rapid RVD. Immunofluorescence studies show that under isotonic conditions TRPV4 is distributed mainly in intracellular compartment in both cell lines. However under hypotonic conditions TRPV4 is translocated to the cell membrane only in AQP2-RCCD1 cells. In this thesis we suggest the existence of a functional interaction between AQP2 and TRPV4, which is essential for the calcium signal generation induced by swelling and necessary for a rapid activation of the mechanisms of cell volume regulation.Fil:Galizia, Luciano. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

Aquaporins: More Than Functional Monomers in a Tetrameric Arrangement

Aquaporins (AQPs) function as tetrameric structures in which each monomer has its own permeable pathway. The combination of structural biology, molecular dynamics simulations, and experimental approaches has contributed to improve our knowledge of how protein conformational changes can challenge its transport capacity, rapidly altering the membrane permeability. This review is focused on evidence that highlights the functional relationship between the monomers and the tetramer. In this sense, we address AQP permeation capacity as well as regulatory mechanisms that affect the monomer, the tetramer, or tetramers combined in complex structures. We therefore explore: (i) water permeation and recent evidence on ion permeation, including the permeation pathway controversy—each monomer versus the central pore of the tetramer—and (ii) regulatory mechanisms that cannot be attributed to independent monomers. In particular, we discuss channel gating and AQPs that sense membrane tension. For the latter we propose a possible mechanism that includes the monomer (slight changes of pore shape, the number of possible H-bonds between water molecules and pore-lining residues) and the tetramer (interactions among monomers and a positive cooperative effect)