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Designing crossing and selection strategies to combine diagnostic markers and quantitative traits
Tese de doutoramento em Biociências, ramo de especialização em Toxicologia, apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de CoimbraDoxorubicin (DOX) is one of the most potent antineoplastic drugs. Although
possessing a superior anti-‐‑cancer activity, a broader clinical use of DOX is limited by
a dose-‐‑dependent, constant and cumulative cardiomyopathy involving deterioration
of mitochondrial function.
Although acute effects of DOX treatment often disappear when treatment finishes,
chronic effects often result in a persistent cardiotoxicity, including a progressive
deterioration of mitochondrial metabolism, the development of cardiomyopathy and
ultimately congestive heart failure. Important in the context of DOX-‐‑induced
cardiotoxicity, mitochondrial disruption has been observed in different models. This
alteration of mitochondrial function is often sub-‐‑clinical and is only manifested as
cardiomyopathy when other factors are combined, including age or different types of
cardiovascular stress. Also, metabolic alterations in the cardiac cell occur, which
contribute to the ability of the heart to withstand increased workloads. Although
mitochondrial disruption is an early and sensitive marker of DOX cardiotoxicity,
how metabolic stress contributes to the development of cardiomyopathy remains to
be determined. Because of this gap in knowledge, the objective of this work was to
use of model of metabolic inhibition in perfused hearts from saline (SAL) and DOX-‐‑
treated rats in order to identify metabolic alterations caused by an acute and sub-‐‑
chronic treatment.
Our assumption for this strategy is that a lower susceptibility to a determined
inhibitor during perfusion, would be a sign of a more robust (i.e. more capacity) of
the targeted pathway(s).
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For the acute treatment protocol, sixteen week-‐‑old male Wistar rats were i.p. injected
with 20mg/Kg DOX or 1mg/Kg 0.9%NaCl and sacrificed 24 hours later. For sub-‐‑
chronic protocol, eight weeks-‐‑old male Wistar rats received seven weekly s.c.
injections with DOX(2mg/Kg) or equivalent SAL solution and sacrificed one week
after the last injection. Following the protocol treatments, animals were sacrificed
and hearts were removed and perfused using a Langendorff apparatus with distinct
cardiac substrates (glucose, galactose plus glutamine -‐‑ GG or octanoate plus malate –
OM). Glycolytic (iodoacetate) and oxidative phosphorylation (rotenone-‐‑ Rot or
cyanide-‐‑ KCN) inhibitors were separately added to the different metabolic
perfusates, aiming to detect undercover mitochondrial defects in the DOX-‐‑treated
group. In non-‐‑perfused hearts, or hearts perfused in the absence (time controls, TC)
or presence of inhibitors, selected metabolic and mitochondrial proteins were semi-‐‑
quantified by Western blotting, and mRNA levels were quantified by RT-‐‑PCR.
In the acute DOX treatment model, hearts perfused with glucose as substrate
suffered a decline in the number of heart beat and rate pressure product (RPP) when
iodoacetate was added, contrarily to Rot or KCN which had no effect. With GG,
inhibitor titration decreased the heart rate, despite that the decrease in the RPP was
more evident in SAL vs. DOX group with iodoacetate and KCN. Perfusion with OM
resulted in decreased heart rate an RPP in the presence of the inhibitors, showing
equal response between treatments. When glycolytic and mitochondrial proteins
were semi-‐‑quantified by Western blotting, alterations in proteins involved in
mitochondrial biogenesis and autophagy were observed in DOX hearts perfused
with inhibitors. The data from the acute protocol study, appears to suggest that
hearts from DOX-‐‑treated animals have improved function in the presence of
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metabolic inhibitors, thus indicating that DOX triggers adaptations that allow the
hearts to be less susceptible to mitochondrial and glycolytic inhibition.
In the sub-‐‑chronic model and using glucose as substrate, the DOX-‐‑treated group
showed again a better tolerability to inhibitors than SAL. With GG, titration with
iodoacetate caused a decrease in heart beat and on RPP in DOX group, when rot or
KCN was added the number of heart beat and RPP remains identical between the
two groups. Glycolytic and mitochondrial proteins semi-‐‑quantification suggested an
impairment of autophagy in DOX perfused hearts perfused, more evident during GG
perfusion. The presence of inhibitors in the perfusion also generally decreased the
total amount of proteins detected by Western Blotting, although glycolytic proteins
were increased when hearts were perfused with glucose, contrarily to GG perfusion.
The results suggest that sub-‐‑chronic DOX-‐‑treated rats suffered a metabolic
remodeling which is based on stronger glycolytic fluxes to maintain contractility,
although no overt mitochondrial defect was uncovered.
A surprising result is that regardless of the perfusion buffer used, no striking
differences between SAL and DOX hearts in terms of hemodynamic parameters were
found.
The present work suggests that metabolic remodeling during DOX acute and sub-‐‑
chronic treatment maintains cardiac function in the treated animals. This remodeling
is apparently based in a stronger contribution of glycolysis to overall metabolism.
Data from protein amount analyzed suggest that DOX treatment in both models
affect important regulators of autophagy, mitochondrial biogenesis as well as the
adenine nucleotide translocator. The results also suggest that a longer treatment
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protocol or resting period should also be tested in order to uncover more profound
differences.A doxorrubicina (DOX) é um dos fármacos antineoplásicos mais potentes. Apesar de
possuir uma actividade anti-‐‑cancro superior, uma mais ampla utilização clínica da
DOX é limitada por uma dose-‐‑dependente, constante e cumulativa cardiomiopatia
que envolve a deterioração da função mitocondrial.
Embora os efeitos agudos do tratamento DOX normalmente desaparece quando se
conclui o tratamento, os efeitos crónicos resultam muitas vezes numa
cardiotoxicidade persistente, incluindo a deterioração progressiva do metabolismo
mitocondrial, o desenvolvimento de cardiomiopatia e por fim insuficiência cardíaca
congestiva. Importante no contexto da cardiotoxicidade induzida pela DOX,
perturbação mitocondrial foi observada em diferentes modelos. Esta alteração da
função mitocondrial é muitas vezes sub-‐‑clínica e só se manifesta como
cardiomiopatia quando outros factores são combinados, incluindo a idade ou
diferentes tipos de estresse cardiovascular. Além disso, ocorrem alterações
metabólicas na célula cardíaca, o que contribui para a capacidade do coração resistir
a maior demanda. Embora a perturbação mitocondrial seja um marcador precoce e
sensível de DOX cardiotoxicidade, como o stress metabólico contribui para o
desenvolvimento de cardiomiopatia permanece por determinar. Devido a essa
lacuna no conhecimento, o objetivo deste trabalho foi a utilização de um modelo de
inibição metabólica em corações perfundidos de ratos tratados com uma solução
salina (SAL) e ratos tratados com DOX, a fim de identificar alterações metabólicas
causadas por um tratamento agudo e sub-‐‑crônico.
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O nosso pressuposto para esta estratégia é que uma menor susceptibilidade a um
determinado inibidor durante a perfusão, seria um sinal de uma forma mais robusta
(ou seja, mais de capacidade) da via-‐‑alvo (s).
Para o protocolo de tratamento agudo, ratos machos Wistar de 16 semanas de idade
foram injectados i.p. com 20 mg / kg de DOX ou de 1 mg / kg a 0,9% de NaCl e
sacrificados 24 horas mais tarde. Para o protocolo sub-‐‑crônico, ratos machos Wistar
de oito semanas de idade, receberam sete injecções s.c. semanais com DOX (2 mg /
kg) ou uma equivalente da solução SAL sendo sacrificados uma semana após a
última injecção. Após o protocolo de tratamentos, os animais foram sacrificados e os
corações foram perfundidos com um aparelho de Langendorff com substratos
cardíacos distintos (glucose, galactose mais glutamina -‐‑ GG ou octanoato mais
malato -‐‑ OM). Inibidores glicolíticos (iodoacetato) e inibidores da fosforilação
oxidativa (Rot-‐‑ rotenona ou KCN-‐‑ cianeto) foram adicionados separadamente nos
diferentes substratos metabólicos, com o objetivo de detectar defeitos mitocondriais
no grupo tratado com DOX. Em corações não perfundidos, ou corações perfundidos
na ausência (controlos de tempo, TC) ou na presença de inibidores, algumas
proteínas metabólicas e proteínas mitocondriais foram semi-‐‑quantificadas por
Western blotting, e os níveis de mRNA foram quantificados por RT-‐‑PCR.
No modelo de tratamento agudo DOX, corações perfundidos com glucose como
substrato sofreram um declínio no número de batimentos cardíacos e produto da
taxa de pressão (RPP), quando iodoacetato foi adicionado, ao contrário da Rot ou
KCN, que não teve nenhum efeito. Com GG, a titulação com o inibidor diminuiu a
frequência cardíaca, apesar de que a diminuição da RPP foi mais evidente no grupo
SAL vs. DOX com iodoacetato e KCN. Perfusão com OM resultou em diminuição da
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frequência cardíaca e do RPP na presença dos inibidores, mostrando uma resposta
igual entre os tratamentos. Quando proteínas glicolíticas e mitocondriais foram semi-‐‑
quantificadas por Western blotting, alterações de proteínas envolvidas na biogênese
mitocondrial e autofagia foram observados em corações DOX perfundidos com
inibidores. Os dados do protocolo de estudo agudo, parecem sugerir que os corações
provenientes de animais tratados com DOX na presença de inibidores, têm a função
metabólica melhorada, indicando assim que a DOX desencadeia adaptações que
permitem que os corações sejam menos susceptíveis à inibição mitocondrial e
glicolítica.
No modelo sub-‐‑crónica e utilizando glucose como substrato, o grupo tratado com
DOX mostrou novamente um melhor tolerabilidade para inibidores que SAL. Com
GG, a titulação com iodoacetato causou uma diminuição no batimento cardíaco e no
RPP em grupo DOX, quando rot ou KCN foi adicionado o número de batimentos
cardíacos e RPP permaneceram idênticos entre os dois grupos. A semi-‐‑quantificação
de proteínas glicolíticas e mitocondriais sugerem uma deficiência da autofagia em
corações DOX perfundidos, mais evidente durante a perfusão com GG. A presença
de inibidores da perfusão geralmente também reduziu a quantidade total de
proteínas detectadas através de Western Blot, embora proteínas glicolíticas
aumentaram quando os corações foram perfundidos com glucose, ao contrário da
perfusão com GG.
Os resultados sugerem que ratos tratados sub-‐‑cronicamente com DOX sofreram uma
remodelação metabólica, que é baseado em fluxos glicolíticos mais fortes para
manter a contratilidade, embora nenhum defeito mitocondrial ostensivo foi
descoberto.
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Um resultado surpreendente é que, independentemente do tampão de perfusão
utilizado, não foram encontradas diferenças marcantes entre SAL e DOX corações em
termos de parâmetros hemodinâmicos.
O presente trabalho sugere que o remodelação metabólica durante o tratamento
agudo e sub-‐‑crônico com DOX, mantém a função cardíaca nos animais tratados. Esta
remodelação é, aparentemente, baseado numa contribuição mais forte da glicólise ao
metabolismo geral. Os resultados de quantidade de proteína analisados sugerem que
o tratamento com DOX em ambos os modelos afectam importantes reguladores da
autofagia e biogénese mitocondrial, bem como o translocador de nucleótidos de
adenina. Os resultados também sugerem que um protocolo de tratamento mais longo
ou com um período de repouso também devem ser testados a fim de descobrir
diferenças mais profundas
Genetic analysis of leaf rolling in wheat
Dissertação de mestrado em Química Farmacêutica Industrial, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de CoimbraAtualmente, as doenças neurodegenerativas como a isquemia cerebral, Alzheimer e Parkinson atacam em massa a população mundial. O acréscimo destas patologias crê-se estar relacionado com falhas na homeostase de zinco e de espécies reativas de oxigénio (ROS) no sistema nervoso central. Neste trabalho questões desta natureza foram investigadas nas sinapses das fibras musgosas da área CA3 do hipocampo de rato.
Os estudos foram efetuados em fatias cerebrais utilizando sondas fluorescentes de zinco e de espécies reativas de oxigénio. Sinais intracelulares de zinco foram medidos utilizando o indicador Newport Green na forma permeante, que não complexa o zinco presente nas vesículas sinápticas e que é co-libertado com o glutamato. As variações de zinco foram induzidas por meio de despolarizações com KCl ou usando um meio extracelular com TEA e rico em cálcio. No primeiro caso verificou-se um aumento significativo dos sinais de fluorescência de zinco. Os resultados obtidos usando antagonistas de recetores de glutamato e um bloqueador de canais de cálcio dependentes do potencial, indicam que aqueles sinais têm origem na zona pós-sináptica.
No meio com TEA e muito cálcio, usado para induzir quimicamente a potenciação de longa duração, que se considera representar uma forma de memorização ao nível celular, verificou-se uma diminuição reversível da intensidade de fluorescência. Este facto pode ser devido à activação, pelo zinco libertado, de canais de K/ATP pré-sinápticos, o que origina a hiperpolarização da membrana e uma diminuição na libertação de zinco.
Alterações na formação de espécies reativas de oxigénio foram estudadas, por meio da sonda H2DCFDA permeante, que é sensível essencialmente aos radicais hidroxilo e peróxido de hidrogénio. Os resultados obtidos, induzidos de forma semelhante aos de zinco, têm dum modo geral um comportamento idêntico ao destes sinais
Inúmeros avanços na indústria e na medicina prometem melhorias ao nível das patologias anteriormente mencionadas e outras. No entanto, existe o reverso da moeda, o aumento da industrialização e de fármacos disponíveis provoca um aumento da poluição em efluentes e águas residuais, tendo em conta que os processos usados nas estações de tratamento não são totalmente eficazes.
III
O sulfametoxazole (SMX) é um antibiótico largamente utilizado, que não é totalmente metabolizado pelo organismo, tendo por isso vindo a ser detetado em águas residuais. Os sinais de zinco medidos aumentam quando as fatias são expostas a esta sulfonamida, voltando ao nível inicial após a mudança para o meio extracelular normal.
O efeito do sulfametoxazole nas espécies reativas de oxigénio também foi testado, tendo-se verificado um aumento daquelas espécies na presença de SMX. Os resultados mostram que a ação deste antibiótico não é reversível, por este motivo, as quantidades ambientais de SMX nas águas residuais assumem uma preocupação crescente. A observação de efeitos irreversíveis na formação de espécies reactivas de oxigénio durante actividade neuronal intensa, sugere que aquele fármaco pode contribuir para diversas patologias neurodegenerativas.Currently, neurodegenerative diseases such as cerebral ischemia, Alzheimer's and Parkinson's mass attack the world population.
The increase of these diseases is believed to be related to failures in the homeostasis of zinc and of reactive oxygen species in the central nervous system. In this work such issues have been investigated in the mossy fiber synapses from area CA3 of the rat hippocampus.
The studies were performed in brain slices using fluorescent probes of zinc and of reactive oxygen species. Intracellular zinc signals were measured using the indicator Newport Green in the permeant form, that does not complex the zinc present in the synaptic vesicles which is co-released with glutamate.
The zinc changes were induced by KCl depolarization or applying an extracellular medium containing TEA and rich in calcium. In the first case a significant increase of the fluorescence zinc signals was observed. The results obtained using antagonists of glutamate receptors and one blocker of voltage-dependent calcium channels, indicate that those signals have a postsynaptic origin.
In the medium containing TEA and high calcium, used to chemically induce long-term potentiation, which is considered to represent a way of memory formation at the cellular level, a reversible decrease of the fluorescence intensity was observed. This fact may be due to the activation, by released zinc, of presynaptic K / ATP channels, which leads to membrane hyperpolarization and to a decrease in zinc release.
Changes in the formation of reactive oxygen species were studied by means of the permeant H2DCFDA probe, which is specially sensitive to the hydroxyl and hydrogen peroxide radicals. The results, induced in a similar way as for zinc, have in general an identical behaviour to that of these signals.
Numerous advances in industry and medicine promise improvements in the above mentioned pathologies and others. However, there is the reverse of the coin, the increasing industrialization and availability of drugs results in increased pollution in waste waters and effluents, since the processes used in water treatment plants are not entirely effective.
V
Sulfamethoxazole (SMX) is a widely used antibiotic, which is not fully metabolized by the organism and, for this reason, is being detected in wastewaters. The measured zinc signals increase when the slices are exposed to this sulfonamide, returning to the initial level after changing to the normal extracellular medium.
The effect of sulfamethoxazole in reactive oxygen species was also tested, having been observed an increase of those species in the presence of SMX. The results show that the action of this antibiotic is not reversible, therefore, their environmental quantities in wastewaters are of growing concern. The observation of irreversible effects on the formation of reactive oxygen species during intense neuronal activity, suggests that that pharmaceutical agent may contribute to various neurodegenerative pathologie
Genetic improvement of wheat for dry environments - a trait based approach
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Epistasis and genotype-by-environment interaction of grain protein content in durum wheat
Parental, F1 , F 2 , BC 1 and BC 2 generations of four crosses involving four cultivars of durum wheat (Triticum durum Desf.) were evaluated at two sites in Tunisia. A three-parameter model was found inadequate for all cases except crosses Chili x Cocorit 71 at site Sidi Thabet and Inrat 69 x Karim at both sites. In most cases a digenic epistatic model was sufficient to explain variation in generation means. Dominance effects (h) and additive x additive epistasis (i) (when significant) were more important than additive (d) effects and other epistatic components. Considering the genotype-by-environment interaction, the non-interactive model (m, d, h, e) was found adequate. Additive variance was higher than environmental variance in three crosses at both sites. The estimated values of narrow-sense heritability were dependent upon the cross and the sites and were 0%-85%. The results indicate that appropriate choice of environment and selection in later generations would increase grain protein content in durum wheat
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