Kinolon Dirençli ve Duyarlı İnvaziv Escherichia Coli Kan İzolatlarında St131/H30 Klon/Subklonunun Virülans ile İlişkisi

Gürpınar Ö., Correlation Between ST131/H30 Clone/Subclone and The Virulence in Fluoroquinolone Resistant and Sensitive Invasive Blood Isolates of Escherichia coli, Hacettepe Un¬vers¬ty Inst¬tute of Health Sc¬ences Microbiology Master of Science Thes¬is, Ankara, 2018. Escherichia coli sequence type 131 (ST131) is a worldwide pandemic clone, causing predominant antimicrobial resistant infections. Subsequent researches have confirmed a worldwide spread of E. coli ST131 clone harbouring broad range of virulence and antibiotic resistance genes. A high prevalence of the clone has been identified in fluoroquinolone resistant E. coli isolates. Geographical distribution of the clone in Asia and the Middle East is very limited and little is known about the ST131 clone in many parts of the developing world. It has not known if there are certain virulence factors those make this ST131 clone such a successful pathogen. This study included all E. coli invasive blood isolates of hospitalized patients during one year period between January-December 2015 in Hacettepe University Hospitals and aimed to determine the antimicrobial susceptibility, molecular detection of antimicrobial resistance genes and virulence factors, and the frequency of ST131/H30 clone/subclones. Antimicrobial susceptibility testing and phenotypic tests of extended spectrum beta-lactamases and carbapenemases of E. coli blood isolates were performed and interpreted in accordance with the CLSI and EUCAST criteria. Distribution of acquired antimicrobial resistance genes; blaCTX-M, blaCTX-M-15, blaKPC, blaNDM, blaIMP, blaOXA-48 and ST131/H30 clone/subclone and virulence genes were defined using polymerase chain reaction. The mean age of 152 patients was 60.3±18.6 and the mean hospitalization time was 25.9±35.1. Distribution of patients according to the services were emergency services (n=63), intensive care unit (n=29), bone marrow transplantation unit (n=3), oncology unit (n=25), surgical services (n=20) and internal medicine services (n=26). The rate of hospital-acquired E. coli infections was 53.3%, mortality was 42%, malignancy was 59.9%. Antibiotic usage rate before bacteremia was 46.1%. Beta lactam/beta-lactamase inhibitors were used in 24.3%, carbapenems in 14.5% and fluoroquinolones in 13.1% of the patients. Urinary and central venous catheterization rate was 36.8% and 20.4% among patients. Antimicrobial resistance rates for SAM, GEN, AMP, CRO, TMP-SMX, CAZ, CTX and CIP were as 23%, 32%, 65%, 23.5%, 37%, 7.7%, 12% and 53.5%, respectively. All isolates were susceptible to IMP and ERT.ST131 was found in 156 (99.4%) and H30 subclone in 111 (70.7%). Among 53.5% ESBL positive isolates, 49.7% were blaCTX-M positive and 45.2% were blaCTX-M-15. Of the CTX-M-15 positive isolates, 97.2% were identified as H30Rx positive. The predominant carbapenemase was blaOXA-48 (21%), followed by blaNDM-1 (1.3%) and blaVIM (3.2%). There was no blaKPC and blaIMP production. Virulence genes ompT (82.2%), iutA (73.2%), usp (64.3%) and papA (22.9%) were common in ST131 isolates. This study showed that the presence of ST131 was high in E. coli bloodstream isolates in our hospital. ST131-infected patients were frequently immunosuppressed with a long history of hospitalization and antibiotic intake prior to bacteremia was high in these patients. blaOXA-48 was the most common carbapenemase; ompT and iutA were the most common virulence genes in ST131 isolates. In conclusion, ST131 clone, in particular the H30Rx subclone showed prominent resistance to fluoroquinolones due to CTX-M-15 type ESBL production. Finding out a parameter to detect virulant clones of E. coli in invasive blood isolates may cause to control drug resistant E. coli infections and may also cause to set more rational antibiotic strategies in empirical therapy of these infections.İÇİNDEKİLER Onay Sayfası iii YAYIMLAMA VE FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI iv ETİK BEYAN v TEŞEKKÜR vi ÖZET vii ABSTRACT viii İÇİNDEKİLER ix SİMGELER ve KISALTMALAR xii ŞEKİLLER xiii TABLOLAR xiv 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 3 2.1. Escherichia coli’nin Tarihçesi 3 2.2. Escherichia coli’nin Üreme Özellikleri 3 2.3. Escherichia coli ST131'in Biyolojik Özellikleri 5 2.3.1. Filogenetik Grup ve Serotipler 5 2.3.2. Virülans Faktörlerini Kodlayan Genler ve Virotipler 5 2.3.3. fimH Alttiplendirme 6 2.3.4. Klinik İzolatlarda Saptanan E. coli ST131'in Fenotipik Antibiyotik Direnci 6 2.3.5. Klinik İzolatlarda E. coli ST131'in Antibiyotik Direnç Genleri 7 2.4. Escherichia coli ST131'in Patojenik Özellikler 9 2.4.1. E. coli ST131 Enfeksiyonları 9 2.4.2. Bulaş Yolları 9 2.4.3. Biyofilm Üretimi ve Metabolik Potansiyeli 10 2.4.4. Adezyon ve Kolonizasyon 10 2.5. E.coli ST131 Klonunun Epidemiyolojisi 11 2.5.1. E. coli ST131 Klonunun Global Dağılımı 11 2.5.2. E. coli ST131 Klonunun Klinik İzolatlar Arasındaki Prevalansı 12 2.5.3. GSBL Pozitif / FQ Dirençli İzolatlar Arasında E. coli ST131 Prevalansı 12 2.5.4. E. coli İzolatları Arasında E. coli ST131 Prevalansı 13 2.5.5. E. coli ST131 ve E. coli ST131 Alt Klonlarının Moleküler Epidemiyolojisi 14 2.6. Hayvansal ve Gıda Kaynaklı E. coli ST131 15 2.6.1. Gıda Hayvanlarında ve Gıda Maddelerinde E. coli ST131 15 2.6.2. Yabani Hayatta Yaşayan Hayvanlarda E. coli ST131 15 2.6.3. Evcil Hayvanlarda E. coli ST131 16 2.7. E. coli ST131 İzolatlarından Korunma ve Kontrol Önlemleri 16 3. GEREÇ VE YÖNTEM 17 3.1. Bakteri İzolatları 17 3.2. İzolatların Tanımlanması 17 3.3. Antibiyotik Duyarlılık Testleri 17 3.3.1. Kullanılan Antibiyotikler 17 3.3.2. İzolatların Hazırlanması 18 3.3.3. Fenotipik Yöntemler 18 3.4. Moleküler Yöntemler 19 3.4.1. DNA İzolasyonu 19 3.4.2. ST131 Klonu ve Alt Klonlarının Moleküler Yöntemle Belirlenmesi 19 3.4.3. Antibiyotik Direnç Genlerinin Moleküler Yöntemle Belirlenmesi 22 3.4.4. Virülans Genlerinin Moleküler Yöntemle Belirlenmesi 27 3.4.5. Agaroz Jel Elektroforezi 32 4. BULGULAR 34 4.1. Hastaların Demografik ve Klinik Özellikleri 34 4.2. Antibiyotik Duyarlılık Test Sonuçları 36 4.3. Genişlemiş Spektrumlu Beta-laktamaz ve Karbapenemaz Saptanmasına Yönelik Yapılan Fenotipik Test Sonuçları 37 4.4. E. coli Kan İzolatlarında ST131 Klonu ve Alt Klonlarının Moleküler Sonuçları 37 4.5. Karbapenem Direnç Genlerinin Moleküler Yöntem Sonuçları 39 4.6. GSBL Direnç Genlerinin Moleküler Çalışma Sonuçları 40 4.7. Virülans Genlerinin Moleküler Olarak Saptanması 41 5. TARTIŞMA 44 6. SONUÇ VE ÖNERİLER 48 7. KAYNAKLAR 49 8. EKLER 61 EK.1 Tez Çalışması ile İlgili Bildiriler ve Yayınlar 61 9. ÖZGEÇMİŞ 68Gürpınar Ö., Kinolon Dirençli ve Duyarlı İnvaziv Escherichia coli Kan İzolatlarında ST131/H30 Klon/Subklonunun Virülans İle İlişkisi, Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Mikrobiyoloji Programı Yüksek Lisans Tezi, Ankara, 2018. Escherichia coli sekans tipi 131 (ST131) dünya genelinde pandemik bir klon olup antimikrobiyal ilaçlara dirençli enfeksiyonlara yol açmaktadır. Yapılan araştırmalar, E. coli ST131 klonunun virülans ve antibiyotik direnç genlerini taşıyabilen dünyada yaygın bir klon olduğunu göstermektedir. Bu klon, özellikle florokinolon dirençli E. coli izolatlarında yüksek insidans göstermektedir. Bu klonun Asya ve özellikle Orta Doğu ülkelerinde coğrafik olarak dağılımı hakkında son derece kısıtlı veri bulunmakta olup gelişmekte olan ülkelerde bu klon ile ilgili bilgiler sınırlıdır. ST131 klonunu bu kadar başarılı bir patojen kılan belirli virülans faktörlerin olup olmadığı bilinmeyen bir durumdur. Bu çalışma, Ocak- Aralık 2015 tarihleri arasında bir yıllık bir dönemde Hacettepe Üniversite Hastanesinde takip edilen hastalardan izole edilen tüm invaziv E. coli kan izolatlarını kapsamakta ve antimikrobiyal duyarlılık testleri ile antimikrobiyal direnç ve virülans genlerinin moleküler tespitini, ST131/H30 klon/alt klonunun sıklığını belirlemeyi amaçlamaktadır. Bu çalışmada, E. coli kan izolatlarında CLSI ve EUCAST önerileri doğrultusunda antimikrobiyal duyarlılık testleri ile genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz ve karbapenemaz saptanmasına yönelik olarak fenotipik testler uygulanmıştır. Kazanılmış direnç genlerinin; blaCTX-M, blaCTX-M-15, blaKPC, blaNDM, blaIMP, blaOXA-48 ve ST131/H30 klon/alt klonu ile virülans genlerinin tespiti polimeraz zincir reaksiyonu ile gerçekleştirilmiştir. Toplam 152 hastanın ortalama yaşı 60,3±18,6 ve hastanede yatış süresi 25,9±35,1 olarak saptanmıştır. Hastaların yattıkları servislere göre dağılımı acil servis (n=63), yoğun bakım ünitesi (n=29), kemik iliği transplantasyon ünitesi (n=3), onkoloji ünitesi (n=25), cerrahi servis (n=20) ve iç hastalıkları servisi (n=26) olarak belirlenmiştir. Hastane kaynaklı E. coli enfeksiyon oranı %53,3, %42, malignite %59,9 olarak bulunmuştur. Bakteriyemi öncesi antibiyotik kullanım oranı %46,1 olup beta laktam/beta-laktamaz inhibitörlerinin kullanımı %24,3, karbapenem kullanımı %14,5 ve florokinolon kullanımı %13,1 olarak belirlenmiştir. Hastalarda idrar ve santral venöz kateter kullanım oranı sırasıyla %36,8 ve %20,4 olarak saptanmıştır. SAM, GEN, AMP, CRO, TMP-SMX, CAZ, CTX ve CIP antibiyotik duyarlılık oranları sırasıyla %23, %32, %65, %23,5, %37, %7,7, %12 ve %53,5 olarak bulunmuştur. Tüm izolatlar IMP ve ERT’e duyarlı olarak saptanmıştır. ST131 156 (%99,4) ve H30 alt klonu 111 (%70,7) izolatta pozitif bulunmuştur. GSBL pozitif saptanan (%53,5) izolatlarda, %49,7 oranında blaCTX-M ve %45,2 oranında da blaCTX-M-15 varlığı tespit edilmiştir. CTX-M-15 pozitif bulunan izolatların %97,2’si H30Rx pozitif bulunmuştur. Karbapenemazlar arasında en sık blaOXA-48 (%21) saptanırken, bunu blaNDM-1 (%1,3) ve blaVIM (%3,2) takip etmiştir. İzolatlarda blaKPC ve blaIMP üretimi saptanmamıştır. E. coli ST131 izolatlarında virülans genlerinin sıklığı ompT (%82,2), iutA (%73,2), usp (%64,3) ve papA (%22,9) olarak belirlenmiştir. Bu çalışma, hastanemizde E. coli kan izolatlarında ST131 klonunun yüksek olduğunu göstermiştir. ST131 ile enfekte hastalar sıklıkla hastanede uzun süreli yatış ve bakteriyemi öncesi antibiyotik kullanım öyküsüne sahip immünsuprese hastalardır. Sonuç olarak, ST131 klonu, özellikle H30Rx alt klonu CTX-M-15 tipi GSBL yapımı nedeniyle florokinolanlara belirgin direnç göstermiştir. Virülan invaziv E. coli kan izolatlarının tespitini sağlayacak bir belirtecin ortaya konulması, antibiyotiklere dirençli E. coli enfeksiyonlarını kontrol edebilecek ve bu enfeksiyonların ampirik tedavisinde akılcıl antibiyotik tedavi stratejileri oluşturacaktır

Levels of pro- and anti-inflammatory cytokines in cystic fibrosis patients with or without gingivitis

Background: Inflammatory periodontal diseases are caused by interaction between gram negative, anaerobic bacteria and host response. Persistent infection of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis (CF) patients also cause increased pro-inflammatory response and the imbalance of pro- and anti-inflammatory response in brochoalveolar lavage fluid which leads to destruction of lungs. The aim of this study is to evaluate periodontal status of CF patients, to measure level of cytokines and biochemical molecules in gingival crevicular fluid (GCF), and to detect presence of P. aeruginosa in dental plaque samples. Materials and methods: GCF samples were collected from 41 CF patients and 39 healthy (non-CF) subjects. Interleukin (IL)-1ß, IL-17, IL-10, human neutrophil elastase (HNE), cystic fibrosis transmembrane regulator (CFTR) protein, and human β-defensin-1 (HBD1) in GCF were evaluated by ELISA method. Dental plaque samples were collected from 18 CF patients with history of P. aeruginosa colonization and 15 non-CF subjects. Presence of P. aeruginosa was evaluated by using conventional culture methods and molecular methods. Results: Levels of IL-1ß, HNE, and HBD1 in CF patients were significantly higher than non-CF subjects. However, IL-10 level was significantly lower in CF patients. Increased pro-inflammatory (IL-1ß) and decreased anti-inflammatory (IL-10) cytokine levels were observed in GCF samples from CF patients, irrespective of their periodontal status. P. aeruginosa were detected in four samples of 18 CF patients, and all were negative in non-CF group. Conclusions: As a result of this study, CF coexists increasing pro-inflammatory and decreasing anti-inflammatory response locally. Due to increasing pro-inflammation, CF patients should be followed-up more often than non-CF children