Caracterização tecnológica de bactérias ácido lácticas isoladas de leite de ovelha para uso potencial como culturas não-iniciadoras

Sheep milk has different physicochemical properties, which means that its derived products have a high added value. Some of these properties are conferred by lactic bacteria which play important roles in the raw milk. This study aimed to analyze five lactic bacteria that were previously identified and evaluated for parameters such as their acidification, proteolysis, diacetyl and exopolysaccharides production, potential antimicrobial activity and safety parameters. The 16S rDNA gene identification via sequencing showed an agreement with the data obtained by MALDI-TOF/MS. The bacteria were identified as Lactococcus lactis MRS1, Lactococcus lactis MRS2, Lactococcus lactis MRS5, Lactococcus lactis MRS6, and Enterococcus faecalis M173. All isolates showed the same acidification profile, maintaining a pH of 4.5 from 6 h of incubation, under the conditions employed. Proteolytic activity, coexistence capacity, and production of exopolysaccharides were observed in all the isolates tested. Diacetyl production was only evident in the isolates Lactococcus lactis MRS1 and Lactococcus lactis MRS2. Regarding the presence of antimicrobial activity, Lactococcus lactis MRS6 and Enterococcus faecalis M173 isolates inhibited all tested cultures. In the evaluation of the safety parameters, none of the isolates presented high-level resistance to clinically important antibiotics and did not present gelatinase production and hemolytic activity. These results provide important information on the potential bacteria that could become valuable additives in sheep milk-derived products, in a condition of starters or adjunct cultures.O leite de ovelha possui diferentes propriedades físico-químicas, o que significa que seus derivados têm alto valor agregado. Parte dessas propriedades é conferida por bactérias lácticas que desempenham importantes atividades no leite cru. Esta pesquisa teve como objetivo analisar cinco bactérias lácticas previamente identificadas e avaliadas quanto a seus parâmetros de acidificação, proteólise, produção de diacetil e exopolissacarídeos, potencial atividade antimicrobiana e parâmetros de segurança. A identificação do gene 16S rDNA por sequenciamento mostrou concordância com os dados obtidos por MALDI-TOF/MS. As bactérias foram identificadas como Lactococcus lactis MRS1, Lactococcus lactis MRS2, Lactococcus lactis MRS5, Lactococcus lactis MRS6 e Enterococcus faecalis M173. Todos os isolados apresentaram o mesmo perfil de acidificação, mantendo o pH em 4,5 a partir de 6 horas de incubação, nas condições empregadas. Atividade proteolítica, capacidade de coexistência e produção de exopolissacarídeos foram observadas em todos os isolados testados. A produção de diacetil foi evidente nos isolados Lactococcus lactis MRS1 e Lactococcus lactis MRS2. Em relação à presença de atividade antimicrobiana, os isolados de Lactococcus lactis MRS6 e Enterococcus faecalis M173 inibiram todas as culturas testadas. Na avaliação dos parâmetros de segurança, nenhum dos isolados apresentou resistência de alto nível a antibióticos clinicamente importantes e não apresentaram produção de gelatinase e atividade hemolítica. Estes resultados fornecem uma informação importante sobre as potenciais bactérias a serem exploradas para a aplicação em produtos derivados de leite de ovelha, em condições de cultura starter ou adjuntas

Características tecnológicas e habilidade de produzir nisina por cepas de Lactococcus lactis subsp. lactis bv. diacetylactis obtidas do ambiente lácteo

Lactococcus lactis subsp. lactis bv. diacetylactis strains are used in the dairy industry to produce acetoin and diacetyl, substances that are responsible for conferring organoleptical characteristics to some fermented foods. Bacteriocin production can be an additional beneficial feature presented by some strains. The identification and characterization of novel Lactococcus strains may reveal distinct attributes that have high technological potential for the dairy industry. This study aimed to characterize the technological and bacteriocinogenic potential of L. lactis subsp. lactis bv. diacetylactis strains obtained from dairy production systems. Twenty-three strains of L. lactis subsp. lactis isolated from cow, goat, and buffalo milks, cow's milk cream, artisanal cheeses from the Amazon region, artisanal cheeses from Marajó Island, forage peanut silages and grass silages were used in this study. The strains were identified at a biovar level (acetoin and dyacetil production, despite specific PCR assays), fingerprinted by rep-PCR and characterized for their technological potential: lactofermentation patterns, extracellular proteolytic activity, acidification capacity, and resistance to NaCl. Subsequently, the strains were subjected to PCR to detect bacteriocin-related genes (nisin, lacticins 481 and 3147, lactococcins A and 972) and further investigated by PCR and sequencing for the nisin operon. Cell free supernatants (CFS) of nisin-positive strains were tested by the spot-on-the lawn assay against a panel of 16 targets (Listeria monocytogenes - 4, L. innocua - 1, Staphylococcus aureus - 6, Lactobacillus sakei - 1, L. lactis - 4). Growth curves of 4 microbial targets (L. monocytogenes - 2, S. aureus - 2), with and without the CFS of nisin producers, were obtained by optical density (λ = 650 nm). Based on a culture collection of 23 L. lactis subsp. lactis strains, 15 presented molecular and phenotypical results that allowed them to be identified as L. lactis subsp. lactis bv. diacetylactis. The rep-PCR analysis showed 11 different genetic profiles with similarity of less than 90%, thus indicating a high level of diversity among the 15 isolates identified as L. lactis subsp. lactis bv. diacetylactis. The technological characterizations indicated that two strains did not present coagulation abilities and 13 were positive for extracellular proteolysis activity. Many of the strains were shown to efficiently acidify skim milk though two strains showed high acidifying capacities, resulting in a pH decrease over 2 units after 24h. NaCl tolerance assay revealed that all these strains were able to grow at all tested concentrations (0, 2, 4, 6, 8 and 10%); nevertheless, strains obtained from non-dairy niches presented higher tolerance to NaCl when compared to the isolated obtained from dairy niches. Eight strains presented positive results only for nisA, and only one strain (SBR4) presented the full nisin operon, confirmed by sequencing as similar to nisin Z. Only SBR4 strain presented inhibitory activity by the spot-on-the lawn assay against the 16 microbial targets. Growth curves of selected targets confirmed the inhibitory activity of the SBR4 strain, especially against S. aureus, indicating its potential for nisin production. Therefore, these results suggest that the studied strains present important technological characteristics for the food industry and that their application is viable for the production of fermented foods. In view of the technological features and the ability to produce nisin of L. lactis subsp. lactis bv. diacetylactis SBR4, it can be used to constitute a starter or mixed culture, being a strain to be considered in the dairy industry as a bioconservative and biotechnological tool.Cepas de Lactococcus lactis subsp. lactis bv. diacetylactis são utilizadas na indústria de laticínios para produzir acetoína e diacetil, que conferem características sensoriais específicas a derivados lácteos fermenados. A produção de bacteriocinas pode ser uma característica benéfica adicional apresentada por algumas cepas. A identificação e caracterização de novas cepas de Lactococcus podem revelar atributos distintos que apresentam grande potencial tecnológico para a indústria de laticínios. Este estudo teve como objetivo caracterizar o potencial tecnológico e bacteriocinogênico de cepas de L. lactis subsp. lactis bv. diacetylactis obtido a partir de sistemas de produção de leite. Vinte e três cepas de L. lactis subsp. lactis isoladas de leite de vaca, cabra e búfala, creme de leite de vaca, queijos artesanais da região amazônica e da Ilha de Marajó, silagem de amendoim forrageiro e silagem de capim foram utilizados neste estudo. As cepas foram identificadas em nível biovar (produção de acetoina e diacetil, além de PCRs específicas) e similariedade genética por rep-PCR e quanto ao seu potencial tecnológico: padrões de lactofermentação, atividade proteolítica extracelular, capacidade de acidificação e resistência ao NaCl. Posteriormente, as cepas foram submetidas à PCR para detectar genes relacionados à bacteriocinas (nisina, lacticina 481 e 3147, lactococina A e 972), e o operon relacionado a produção de nisina foi sequenciado para identificação de variações na produção dessa bacteriocina. Os sobrenadantes livres de células (CFS) de cepas positivas para os genes relacionados a produção de nisina foram testados pelo ensaio spot-on-the-lawn frente a um painel de 16 alvos (Listeria monocytogenes - 4, L. innocua - 1, Staphylococcus aureus - 6, Lactobacillus sakei - 1, L. lactis - 4). Curvas de crescimento de 4 alvos microbianos (L. monocytogenes - 2, S. aureus - 2), isoladamente e na presença do CFS dos produtores de nisina, foram obtidas por densidade óptica (λ = 650 nm). A partir da coleção de culturas de 23 cepas de L. lactis subsp. lactis, 15 cepas apresentaram resultados moleculares e fenotípicos que permitiram sua identificação como L. lactis subsp. lactis bv. diacetylactis. A análise de rep-PCR demostrou 11 perfis genéticos diferentes com similariedade inferior a 90%, indicando um alto nível de diversidade entre as 15 cepas identificadas como L. lactis subsp. lactis bv. diacetilactis. A caracterização tecnológica indicou que duas cepas não apresentaram habilidades de coagulação e 13 foram positivas para a atividade proteolítica extracelular. Muitas cepas se mostraram eficientes para acidificar leite, e duas cepas apresentaram alta capacidade de acidificação, resultando em uma redução do pH em 2 unidades após 24h. O ensaio de tolerância ao NaCl revelou que todas as cepas foram capazes de se multiplicar em diferentes concentrações (0, 2, 4, 6, 8 e 10%); entretanto, cepas isoladas de nichos não lácteos mostraram uma tolerância ainda maior ao NaCl (10%). Para os genes relacionados à bacteriocina, oito cepas apresentaram resultados positivos apenas para nisA, e apenas uma cepa (SBR4) apresentou o operon completo da nisina, confirmado pelo sequenciamento como similar à nisina Z. Apenas a cepa SBR4 apresentou atividade inibitória pelo ensaio spot-on-the lawn frente os 16 alvos microbianos. Curvas de crescimento de alvos selecionados confirmaram a atividade inibitória da cepa SBR4, especialmente contra S. aureus, indicando seu potencial para produção de nisina. Deste modo, esses resultados indicam que as cepas estudadas apresentam características tecnológicas importantes para a indústria de alimentos e que sua aplicação é viável para a produção de alimentos fermentados. Considerando as características tecnológicas de L. lactis subsp. lactis bv. diacetylactis SBR4, além de sua capacidade de produzir nisina, essa pode ser usada para constituir uma cultura starter ou mista, sendo uma linhagem a ser considerada na indústria de laticínios como uma ferramenta bioconservadora e biotecnológica.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superio

Nova percepção da atividade antibacteriana dos sais emulsificantes utilizados no queijo processado: da aplicação in vitro à aplicação in situ

Processed cheese (PC) is a dairy product with multiple end-use applications, where emulsifying salts play a fundamental role in physicochemical changes during production. Moreover, some of these salts may be a strategy to control spoilage and pathogenic microorganisms, contributing to safety and shelf-life extension. In the construction of this thesis, four steps were employed to assess the antimicrobial activity of different emulsifying salts. (i) In the first step, the inhibitory activity of a commercial polyphosphate (JOHA ® HBS, at different concentrations, from 0.2% to 3.0%) was tested in vitro against 21 bacterial strains by streak assay, agar-spot method, spot-on-the-lawn and well-diffusion method. Different culture medium (Brain Heart Infusion Broth, Nutrient, Plate Count, Trypticase Soy), either in liquid or solid form, were used. In all the protocols performed, the solid culture medium (Nutrient agar) was more effective for the inhibition of the target bacteria; results of the streak assay showed that 11 out the 21 tested strains were highly inhibited at 0.5% of JOHA ® HBS. (ii) In this step, we selected Bacillus thuringiensis CFBP 3476 and Clostridium perfringens ATCC 13124 to access the in situ inhibitory activity of two emulsifying salts (ESSP = short polyP and BSLP = long polyP). PC samples were produced through laboratory-scale and pilot-scale, inoculated and analyzed until 45 days of storage at 6 ± 2 ºC. C. perfringens ATCC 13124 growth was not affected (p > 0.05), but both of the treatments reduced B. thuringiensis CFBP 4376 counts in the tested conditions (p 0,05), mas ambos os tratamentos reduziram as contagens de B. thuringiensis CFBP 4376 nas condições testadas (p < 0,05); obteve-se uma redução maior e mais rápida nas amostras produzidas pelo método em escala laboratorial. (iii) Na terceira etapa, um total de 14 tratamentos (T1-T14) compostos por misturas de sais emulsificantes (ESSP, BSLP e citrato trissódico) e aditivos antimicrobianos (nisina e sorbato de potássio) foram avaliados contra oito cepas alvo. Amostras de QP foram produzidas em escala laboratorial, inoculadas e analisadas até 90 dias de armazenamento a 6 ± 2 ºC. A maioria dos tratamentos resultou em algum nível de efeito bactericida ou bacteriostático contra os microrganismos alvo. A atividadebactericida foi evidente contra Bacillus spp., e o efeito bacteriostático foi claro contra C. perfringens ATCC 13124, Enterococcus faecalis FAIR-E 179, Listeria monocytogenes Scott A e Staphylococcus aureus ATCC 6538 (p < 0,05) durante o período de estocagem. Os tratamentos em que o BSLP foi aplicado isoladamente apresentaram maior atividade inibitória; isto é, concentrações iguais de BSLP resultam em menos inibição bacteriana quando na presença de ESSP. (iv) Na última etapa, o efeito bacteriostático de seis sais emulsificantes, contendo diferentes concentrações de pentóxido de fósforo (P 2 O 5 ), foi investigado em amostras de QP deliberadamente contaminadas com esporos de B. cereus. Também foi avaliada a influência dos métodos de processamento do QP (pasteurização e creme), temperatura de armazenamento (6 e 30 ºC) e tempo de armazenamento (até 120 dias). Os resultados mostraram que temperaturas de armazenamento mais baixas e os sais emulsificantes influenciaram significativamente o crescimento bacteriano. Além disso, o processo de cremificação e o teor de P 2 O 5 potencializaram o efeito inibitório dos sais emulsificantes; QP tratado com a maior concentração de P 2 O 5 apresentou o menor valor médio tanto de células vegetativas quanto de esporos. Por fim, as quatro etapas deste estudo revelam que: (i) o meio de cultura Nutriente e os testes baseados em ágar são necessários para avaliar adequadamente a atividade inibitória de polifosfatos; (ii) foi confirmado o efeito inibitório de sais emulsificantes contra B. thuringiensis em PC obtido por dois métodos diferentes; (iii) a composição dos sais emulsificantes influencia significativamente a inibição bacteriana e as interações do fosfato podem inferir tal atividade e; (iv) o processo de cremificação e o teor de P 2 O 5 podem melhorar o efeito inibitório de sais emulsificantes sobre o crescimento vegetativo e de esporos de B. cereus em QP. Considerando tudo, os resultados contribuem para ampliar o entendimento da aplicação de sais emulsificantes em QP, com foco na segurança microbiológica e vida de prateleira. No entanto, estudos mais detalhados são necessários para determinar a composição específica do sal emulsificante e a relação do teor de P 2 O 5 responsável pela inibição bacteriana. Palavras-chave: Produtos lácteos. Emulsificantes. Estabilidade microbiológica. Bactérias patogênicas. Polifosfatos. Vida de prateleira.CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superio

Technological characterization of lactic acid bacteria isolated from sheep milk for potential use as non-starter cultures

Sheep milk has different physicochemical properties, which means that its derived products have a high added value. Part of these properties is conferred by lactic bacteria which play important activities in the raw milk. This research aimed to analyze five lactic bacteria that were previously identified and evaluated for parameters as their acidification, proteolysis, diacetyl and exopolysaccharides production, potential antimicrobial activity and the safety parameters. The 16S rDNA gene identification by sequencing showed an agreement with the data obtained by MALDI-TOF/MS. The bacteria were identified as Lactococcus lactis MRS1, Lactococcus lactis MRS2, Lactococcus lactis MRS5, Lactococcus lactis MRS6, and Enterococcus faecalis M173. All isolates showed the same acidification profile, maintaining pH at 4.5 from 6 h of incubation along, under the conditions employed. Proteolytic activity, coexistence capacity, and production of exopolysaccharides were observed in all the isolates tested. Diacetyl production was only evident in the isolates Lactococcus lactis MRS1 and Lactococcus lactis MRS2. Regarding the presence of antimicrobial activity, Lactococcus lactis MRS6 and Enterococcus faecalis M173 isolates inhibited all tested cultures. In the evaluation of the safety parameters, none of the isolates presented high-level resistance to clinically important antibiotics and did not present gelatinase production and hemolytic activity. These results provide an important information on the potential bacteria to be exploited for the application in sheep milk-derived products, in a condition of starters or adjunct cultures.O leite de ovelha possui diferentes propriedades físico-químicas, o que significa que seus derivados têm alto valor agregado. Parte dessas propriedades é conferida por bactérias lácticas que desempenham importantes atividades no leite cru. Esta pesquisa teve como objetivo analisar cinco bactérias lácticas previamente identificadas e avaliadas quanto a seus parâmetros de acidificação, proteólise, produção de diacetil e exopolissacarídeos, potencial atividade antimicrobiana e parâmetros de segurança. A identificação do gene 16S rDNA por sequenciamento mostrou concordância com os dados obtidos por MALDI-TOF/MS. As bactérias foram identificadas como Lactococcus lactis MRS1, Lactococcus lactis MRS2, Lactococcus lactis MRS5, Lactococcus lactis MRS6 e Enterococcus faecalis M173. Todos os isolados apresentaram o mesmo perfil de acidificação, mantendo o pH em 4,5 a partir de 6 horas de incubação, nas condições empregadas. Atividade proteolítica, capacidade de coexistência e produção de exopolissacarídeos foram observadas em todos os isolados testados. A produção de diacetil foi evidente nos isolados Lactococcus lactis MRS1 e Lactococcus lactis MRS2. Em relação à presença de atividade antimicrobiana, os isolados de Lactococcus lactis MRS6 e Enterococcus faecalis M173 inibiram todas as culturas testadas. Na avaliação dos parâmetros de segurança, nenhum dos isolados apresentou resistência de alto nível a antibióticos clinicamente importantes e não apresentaram produção de gelatinase e atividade hemolítica. Estes resultados fornecem uma informação importante sobre as potenciais bactérias a serem exploradas para a aplicação em produtos derivados de leite de ovelha, em condições de cultura starter ou adjuntas

Diversity of Filamentous Fungi Associated with Dairy Processing Environments and Spoiled Products in Brazil

Few studies have investigated the diversity of spoilage fungi from the dairy production chain in Brazil, despite their importance as spoilage microorganisms. In the present study, 109 filamentous fungi were isolated from various spoiled dairy products and dairy production environments. The isolates were identified through sequencing of the internal transcribed spacer (ITS) region. In spoiled products, Penicillium and Cladosporium were the most frequent genera of filamentous fungi and were also present in the dairy environment, indicating that they may represent a primary source of contamination. For dairy production environments, the most frequent genera were Cladosporium, Penicillium, Aspergillus, and Nigrospora. Four species (Hypoxylon griseobrunneum, Rhinocladiella similis, Coniochaeta rosae, and Paecilomyces maximus) were identified for the first time in dairy products or in dairy production environment. Phytopathogenic genera were also detected, such as Montagnula, Clonostachys, and Riopa. One species isolated from the dairy production environment is classified as the pathogenic fungi, R. similis. Regarding the phylogeny, 14 different families were observed and most of the fungi belong to the Ascomycota phylum. The understanding of fungal biodiversity in dairy products and environment can support the development of conservation strategies to control food spoilage. This includes the suitable use of preservatives in dairy products, as well as the application of specific cleaning and sanitizing protocols designed for a specific group of target microorganisms

Influence of Emulsifying Salts on the Growth of Bacillus thuringiensis CFBP 3476 and Clostridium perfringens ATCC 13124 in Processed Cheese

Processed cheese is a dairy product with multiple end-use applications, where emulsifying salts play a fundamental role in physicochemical changes during production. Moreover, some of these salts may be a strategy to control spoilage and pathogenic microorganisms, contributing to safety and shelf life extension. This study aimed to evaluate the in vitro inhibitory activity of two emulsifying salts (ESSP = short polyP and BSLP = long polyP) against Bacillus thuringiensis CFBP 3476 and Clostridium perfringens ATCC 13124, and to compare the in situ effects of two emulsifying salts treatments (T1 = 1.5% ESSP and T2 = 1.0% ESSP + 0.5% BSLP) in processed cheeses obtained by two different methods (laboratory- and pilot-scales), during 45-day storage at 6 &deg;C. C. perfringens ATCC 13124 growth was not affected in vitro or in situ (p &gt; 0.05), but both of the treatments reduced B. thuringiensis CFBP 4376 counts in the tested condition. Counts of the treatments with B. thuringiensis CFBP 3476 presented a higher and faster reduction in cheeses produced by the laboratory-scale method (1.6 log cfu/g) when compared to the pilot-scale method (1.8 log cfu/g) (p &lt; 0.05). For the first time, the inhibitory effect of emulsifying salts in processed cheeses obtained by two different methods was confirmed, and changes promoted by laboratory-scale equipment influenced important interactions between the processed cheese matrix and emulsifying salts, resulting in B. thuringiensis CFBP 4376 growth reduction