Atividade antifúngica e modo de ação do óleo essencial de Coriandrum sativum L. (coentro) sobre Candida spp. e alvos moleculares afetados na expressão do genoma humano

Orientadores: Pedro Luiz Rosalen, Marta Cristina Teixeira DuarteDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de PiracicabaResumo: Introdução: A candidíase oral é uma infecção fúngica oportunista da cavidade oral, cujas taxas de prevalência e incidência vêm aumentando significativamente em todo o mundo. Assim, novas estratégias orientadas para gerir esta doença têm sido propostas, dentre as quais está o uso de óleos essenciais (OE) com propriedades antifúngicas. Evidências indicam que o OE de Coriandrum sativum L. (coentro) é um forte agente antifúngico contra Candida e, portanto, investigações devem dar continuidade ao conhecimento gerado. Objetivo: Este estudo buscou avaliar a atividade antifúngica e modo de ação do OE de C. sativum sobre Candida spp., e determinar os alvos moleculares afetados na expressão global do genoma humano. Material e Métodos: C. sativum foi obtido a partir do Banco de Germoplasmas do Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (Universidade Estadual de Campinas, SP, Brasil) cujo OE e fração ativa tiveram o perfil fitoquímico determinado por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa. Posteriormente, foram realizados testes com cinco cepas de referência de Candida: Determinação da Concentração Inibitória e Fungicida Mínima (CIM/CFM); modo de ação antifúngica (ensaio do sorbitol e ergosterol); Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) de biofilmes de Candida e testes de inibição de aderência em biofilme. Utilizou-se nistatina, anfotericina B ou caspofungina como controles positivos, além de controles negativos. Também, foi testado o efeito do OE sobre a atividade proteolítica de C. albicans. Por fim, um ensaio de farmacogenômica identificou quais alvos moleculares no genoma humano foram afetados pelo OE e fração ativa de C. sativum. Os testes foram realizados em triplicata de experimentos independentes e os dados foram tratados estatisticamente (ANOVA, pós-teste de Tukey, ?=0,05). Os dados da análise farmacogenômica foram processados nas plataformas GeneGo MetaCore® e David Bioinformatics Resources. Resultados: O perfil fitoquímico EO indicou monoterpenos (37,9%) e sesquiterpenos (62,1%) como compostos principais. Os valores de CIM/CFM para o OE variaram de 15,6 a 62,5 µg/mL. Quanto ao modo de ação, o OE de C. sativum parece se ligar ao ergosterol da membrana celular fúngica, aumentando a permeabilidade iônica e causando morte celular; entretanto, o OE não atua sobre vias de biossíntese da parede celular. Estes achados confirmam as alterações na integridade da morfologia do biofilme verificadas nas análises por MEV. Além disso, o OE apresentou atividade antiaderente em biofilme em baixas concentrações (15,6-62,5 µg/mL) contra as cepas testadas, bem como atividade contra proteases produzidas por C. albicans, sendo estatisticamente significante na CIM (p<0,05). Finalmente, o OE e sua fração ativa apresentaram baixa citotoxicidade em células humanas com CI30 de 359,8 e 366,7 µg/mL, respectivamente. As principais vias afetadas estão relacionadas com quimiocinas e MAP-quinase (apoptose, proliferação) bem como proteínas de adesão. Conclusões: O OE das folhas de C. sativum tem forte atividade antifúngica e antiaderente sobre Candida spp. e atividade anti-proteolítica sobre C. albicans, e atua aumentando a permeabilidade iônica da membrana celular, provavelmente devido ao efeito sinérgico de mono e sesquiterpenos. Análise farmacogenômica indicou baixa citotoxicidade do OE e sua fração ativa com alvos moleculares específicos afetados no genoma humano, o que incentiva o desenvolvimento de novas pesquisas pré-clínicas toxicológicas e clínicas nesta áreaAbstract: Introduction: Oral candidiasis is a common opportunistic fungal infection of the oral cavity with increasingly significant worldwide prevalence and incidence rates. Accordingly, novel specific-targeted strategies to manage this ailment have been proposed, among which is the use of essential oils (EO) with antifungal properties. Coriandrum sativum L. (coriander) EO has proven antifungal activity against Candida species and thus deserves further investigation. Objective: This study aimed to evaluate the antifungal activity and mode of action of the EO from Coriandrum sativum L. leaves on Candida spp., and to determine the molecular targets affected in the whole-genome expression in human cells. Material and Methods: C. sativum was obtained from the Germoplasm Bank of the Research Center for Chemistry, Biology and Agriculture (University of Campinas, SP, Brazil) whose EO and active fraction had their phytochemical profile determined by Gas Chromatography coupled to Mass Spectrometry. Then, we carried out the following tests with five reference strains of Candida spp. (CBS): Minimum Inhibitory and Fungicidal Concentration (MIC/MFC); antifungal mode of action (sorbitol and ergosterol assays); Scanning Electron Microscopy (SEM) analysis of Candida biofilm and tests of inhibition of biofilm adherence. We used nystatin, amphotericin B or caspofungin as positive controls, in addition to negative controls. Also, we tested the effect of C. sativum EO on the proteolytic activity of C. albicans. Next, a pharmacogenomic assay identified which molecular targets in the human genome were affected by C. sativum EO and its active fraction. Tests were performed in triplicate of independent experiments and data were statistically treated (ANOVA, Tukey¿s post-test, ?=0.05). Pharmacogenomic data were processed on GeneGo MetaCore® and DAVID Bioinformatics Resources. Results: The EO phytochemical profile indicated monoterpenes (37.9 %) and sesquiterpenes (62.1 %) as major compounds. The MIC/MFC values for the EO ranged from 15.6 to 62.5 µg/ml. With regard to the mode of action, C. sativum EO may bind to membrane ergosterol, increasing ionic permeability and causing membrane damage to cell death, but it does not act on cell wall biosynthesis-related pathways. This mode of action confirms the changes in the integrity of the biofilm morphology as verified in the analyses by SEM. The EO showed anti-adherent activity at low concentrations (31.2 ¿ 62.5 µg/ml) against all strains tested, as well as activity against proteases produced by C. albicans, with statistical significance at MIC (P < 0.05). Finally, the EO and its active fraction had low cytotoxicity on human cells with IC30 of 359.8 and 366.7 µg/ml, respectively, affecting the pathways of chemokines and MAP-kinase (apoptosis, proliferation), as well as adhesion proteins. Conclusions: The EO from C. sativum leaves has strong antifungal and anti-adherent activity against Candida spp., as well as anti-proteolytic activity against C. albicans, and acts by increasing cell membrane ionic permeability, probably due to the synergistic effect of mono- and sesquiterpenes. Pharmacogenomic analyses revealed low cytotoxicity with specific targets affected in the human genome, which encourages further pre-clinical toxicological screening and clinical research in this fieldMestradoFarmacologia, Anestesiologia e TerapeuticaMestre em Odontologi

The role of Streptococcus mutans Cnm in intracellular invasion, adhesion to human cardiac tissues, and cariogenicity in vivo

Orientador: Pedro Luiz RosalenTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de PiracicabaResumo: Um dos principais agentes etiológicos da cárie dentária, Streptococcus mutans, dispõe de um sofisticado repertório de mecanismos de sobrevivência e virulência, pelos quais pode causar doenças orais e extra-orais. A capacidade de S. mutans interagir com componentes de matriz extracelular tecidual, tais como colágeno, permite a colonização de diferentes tecidos do hospedeiro. Previamente, demonstramos que a proteína ligante de colágeno Cnm (~120 kDa) promove adesão ávida de S. mutans à dentina radicular ex vivo e aumenta cárie coronária in vivo. Todavia, a influência de Cnm sobre o desenvolvimento de cárie radicular, onde o colágeno é abundante, permanece desconhecida. No Capítulo I, utilizamos um modelo de ratos dessalivados sob alto desafio cariogênico para investigar o papel de Cnm no desenvolvimento de cárie radicular. Ratos infectados com a cepa OMZ175?cnm (knockout) apresentaram menos cárie coronária com envolvimento inicial de dentina quando comparados aos infectados com a cepa selvagem OMZ175 e a complementada OMZ175Acnm::pcnm (p<0,05) após 5 semanas. No entanto, não foram observadas diferenças significativas quanto ao desenvolvimento de cárie radicular. Interessantemente, os ratos infectados com OMZ175 ou OMZ175?cnm::pcnm apresentaram maior exposição radicular (até cerca de 18,5% mais elevada, P <0,05) do que aqueles infectados com OMZ175?cnm ou UA159 (cepa naturalmente negativa para Cnm). Em síntese, este capítulo descreve a contribuição de Cnm no desenvolvimento da cárie, particularmente nos estágios iniciais de lesão dentinária, e destaca seu potencial impacto no desenvolvimento de doenças periodontais e destruição óssea alveolar, a ser investigado em estudos futuros. Há também evidências de que Cnm desempenha um papel importante, e ainda subestimado, no desenvolvimento de doenças cardiovasculares. Contudo, ainda não se conhecem os mecanismos pelos quais patógenos orais Cnm+ colonizam e persistem em tecidos cardíacos humanos. No Capítulo II, utilizamos um sistema de expressão heteróloga em Lactococcus lactis NZ9800 para investigar o papel de Cnm na invasão intracelular, adesão a tecidos cardíacos ex vivo e desenvolvimento de endocardite infecciosa (EI) in vivo. Semelhante a S. mutans, a expressão de Cnm em L. lactis mediou ligação ao colágeno e laminina, invasão de células endoteliais da artéria coronária humana e aumentou a virulência em larvas de Galleria mellonella (p<0,05). Utilizando um modelo de colonização da valva aórtica humana ex vivo, demonstramos que as cepas Cnm+ de S. mutans ou L. lactis colonizaram tecidos da valva aórtica de 10 a 100 vezes mais que as cepas Cnm- (p<0,001). Finalmente, um ensaio de EI em coelhos revelou que a cepa Cnm+ de L. lactis foi recuperada de tecidos cardíacos com uma frequência significativamente mais elevada (~ 70%, p=0,0001) em relação à cepa Cnm-. Em síntese, este capítulo descreve que a presença de Cnm é suficiente para conferir virulência a um organismo não patogênico e confirma a utilidade do sistema heterólogo de L. lactis para caracterização adicional de fatores de virulência bacterianos. Coletivamente, os nossos resultados fornecem evidência de que a ligação a componentes da matriz extracelular tecidual mediada por Cnm é um atributo de virulência importante de S. mutans para o desenvolvimento de doenças orais e sistêmicasAbstract: One of the major etiological pathogens of dental caries, Streptococcus mutans, utilizes a sophisticated repertoire of survival and virulence mechanisms, thereby potentially causing oral and extra-oral diseases. The ability of S. mutans to interact with tissue extracellular matrix components, such as collagen, enables colonization of different host tissues. Previously, we demonstrated that the 120-kDa surface collagen-binding protein Cnm promotes stringent adhesion of S. mutans to root dentin ex vivo and increases coronal caries in vivo. Nevertheless, the impact of Cnm on root caries development, where collagen is abundant, remains unknown. In Chapter I, we used a desalivated rat model under a highly cariogenic challenge to investigate whether Cnm contributes to root caries development. Rats infected with the cnm-knockout strain OMZ175?cnm showed lower levels of slight dentinal smooth-surface caries when compared to the wild type OMZ175 and complemented strain OMZ175?cnm::pcnm (P<0.05) after 5 weeks. Nevertheless, no significant differences were observed for root caries development. Surprisingly, rats infected with OMZ175 or OMZ175?cnm::pcnm showed increased root surface exposure (up to ~18.5% higher, P<0.05) than those infected with OMZ175?cnm or UA159 (naturally defective for Cnm). In summary, this chapter describes the contribution of Cnm to caries development, particularly in early stages of lesion severity, and highlights its potential impact on periodontal diseases and alveolar bone destruction. Cnm has also been reported to play an important and underestimated role in the onset of cardiovascular diseases. Yet, the mechanisms employed by Cnm+ oral pathogen to colonize and persist in human heart tissues are still poorly understood. In Chapter II, we used a heterologous expression system in Lactococcus lactis NZ9800 to investigate the role of Cnm in intracellular invasion, adhesion to cardiac tissues ex vivo and development of infective endocarditis (IE) in vivo. Similar to S. mutans, expression of Cnm in L. lactis enabled robust binding to collagen and laminin, invasion of human coronary artery endothelial cells and increased virulence in Galleria mellonella larvae (P<0.05). Using an ex vivo human heart tissue colonization model, we showed that Cnm+ strains of either S. mutans or L. lactis outcompete their Cnm- counterparts by 10-100 fold for tissue colonization (P<0.001). Finally, a rabbit IE assay showed that the L. lactis Cnm+ strain was recovered from heart tissues at significantly higher frequencies (~70%, p=0.0001) than the L. lactis Cnm- strain. In summary, this chapter describes that Cnm is enough to confer virulence to an otherwise non-pathogenic organism and confirms the usefulness of the L. lactis heterologous system for further characterization of bacterial virulence factors. Collectively, our results provide evidence that binding to extracellular matrix components mediated by Cnm is an important virulence attribute of S. mutans to cause oral and systemic diseasesDoutoradoFarmacologia, Anestesiologia e TerapeuticaDoutor em Odontologia2013/25080-7FAPES