Orientador: Pedro Luiz RosalenTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de PiracicabaResumo: Um dos principais agentes etiológicos da cárie dentária, Streptococcus mutans, dispõe de um sofisticado repertório de mecanismos de sobrevivência e virulência, pelos quais pode causar doenças orais e extra-orais. A capacidade de S. mutans interagir com componentes de matriz extracelular tecidual, tais como colágeno, permite a colonização de diferentes tecidos do hospedeiro. Previamente, demonstramos que a proteína ligante de colágeno Cnm (~120 kDa) promove adesão ávida de S. mutans à dentina radicular ex vivo e aumenta cárie coronária in vivo. Todavia, a influência de Cnm sobre o desenvolvimento de cárie radicular, onde o colágeno é abundante, permanece desconhecida. No Capítulo I, utilizamos um modelo de ratos dessalivados sob alto desafio cariogênico para investigar o papel de Cnm no desenvolvimento de cárie radicular. Ratos infectados com a cepa OMZ175?cnm (knockout) apresentaram menos cárie coronária com envolvimento inicial de dentina quando comparados aos infectados com a cepa selvagem OMZ175 e a complementada OMZ175Acnm::pcnm (p<0,05) após 5 semanas. No entanto, não foram observadas diferenças significativas quanto ao desenvolvimento de cárie radicular. Interessantemente, os ratos infectados com OMZ175 ou OMZ175?cnm::pcnm apresentaram maior exposição radicular (até cerca de 18,5% mais elevada, P <0,05) do que aqueles infectados com OMZ175?cnm ou UA159 (cepa naturalmente negativa para Cnm). Em síntese, este capítulo descreve a contribuição de Cnm no desenvolvimento da cárie, particularmente nos estágios iniciais de lesão dentinária, e destaca seu potencial impacto no desenvolvimento de doenças periodontais e destruição óssea alveolar, a ser investigado em estudos futuros. Há também evidências de que Cnm desempenha um papel importante, e ainda subestimado, no desenvolvimento de doenças cardiovasculares. Contudo, ainda não se conhecem os mecanismos pelos quais patógenos orais Cnm+ colonizam e persistem em tecidos cardíacos humanos. No Capítulo II, utilizamos um sistema de expressão heteróloga em Lactococcus lactis NZ9800 para investigar o papel de Cnm na invasão intracelular, adesão a tecidos cardíacos ex vivo e desenvolvimento de endocardite infecciosa (EI) in vivo. Semelhante a S. mutans, a expressão de Cnm em L. lactis mediou ligação ao colágeno e laminina, invasão de células endoteliais da artéria coronária humana e aumentou a virulência em larvas de Galleria mellonella (p<0,05). Utilizando um modelo de colonização da valva aórtica humana ex vivo, demonstramos que as cepas Cnm+ de S. mutans ou L. lactis colonizaram tecidos da valva aórtica de 10 a 100 vezes mais que as cepas Cnm- (p<0,001). Finalmente, um ensaio de EI em coelhos revelou que a cepa Cnm+ de L. lactis foi recuperada de tecidos cardíacos com uma frequência significativamente mais elevada (~ 70%, p=0,0001) em relação à cepa Cnm-. Em síntese, este capítulo descreve que a presença de Cnm é suficiente para conferir virulência a um organismo não patogênico e confirma a utilidade do sistema heterólogo de L. lactis para caracterização adicional de fatores de virulência bacterianos. Coletivamente, os nossos resultados fornecem evidência de que a ligação a componentes da matriz extracelular tecidual mediada por Cnm é um atributo de virulência importante de S. mutans para o desenvolvimento de doenças orais e sistêmicasAbstract: One of the major etiological pathogens of dental caries, Streptococcus mutans, utilizes a sophisticated repertoire of survival and virulence mechanisms, thereby potentially causing oral and extra-oral diseases. The ability of S. mutans to interact with tissue extracellular matrix components, such as collagen, enables colonization of different host tissues. Previously, we demonstrated that the 120-kDa surface collagen-binding protein Cnm promotes stringent adhesion of S. mutans to root dentin ex vivo and increases coronal caries in vivo. Nevertheless, the impact of Cnm on root caries development, where collagen is abundant, remains unknown. In Chapter I, we used a desalivated rat model under a highly cariogenic challenge to investigate whether Cnm contributes to root caries development. Rats infected with the cnm-knockout strain OMZ175?cnm showed lower levels of slight dentinal smooth-surface caries when compared to the wild type OMZ175 and complemented strain OMZ175?cnm::pcnm (P<0.05) after 5 weeks. Nevertheless, no significant differences were observed for root caries development. Surprisingly, rats infected with OMZ175 or OMZ175?cnm::pcnm showed increased root surface exposure (up to ~18.5% higher, P<0.05) than those infected with OMZ175?cnm or UA159 (naturally defective for Cnm). In summary, this chapter describes the contribution of Cnm to caries development, particularly in early stages of lesion severity, and highlights its potential impact on periodontal diseases and alveolar bone destruction. Cnm has also been reported to play an important and underestimated role in the onset of cardiovascular diseases. Yet, the mechanisms employed by Cnm+ oral pathogen to colonize and persist in human heart tissues are still poorly understood. In Chapter II, we used a heterologous expression system in Lactococcus lactis NZ9800 to investigate the role of Cnm in intracellular invasion, adhesion to cardiac tissues ex vivo and development of infective endocarditis (IE) in vivo. Similar to S. mutans, expression of Cnm in L. lactis enabled robust binding to collagen and laminin, invasion of human coronary artery endothelial cells and increased virulence in Galleria mellonella larvae (P<0.05). Using an ex vivo human heart tissue colonization model, we showed that Cnm+ strains of either S. mutans or L. lactis outcompete their Cnm- counterparts by 10-100 fold for tissue colonization (P<0.001). Finally, a rabbit IE assay showed that the L. lactis Cnm+ strain was recovered from heart tissues at significantly higher frequencies (~70%, p=0.0001) than the L. lactis Cnm- strain. In summary, this chapter describes that Cnm is enough to confer virulence to an otherwise non-pathogenic organism and confirms the usefulness of the L. lactis heterologous system for further characterization of bacterial virulence factors. Collectively, our results provide evidence that binding to extracellular matrix components mediated by Cnm is an important virulence attribute of S. mutans to cause oral and systemic diseasesDoutoradoFarmacologia, Anestesiologia e TerapeuticaDoutor em Odontologia2013/25080-7FAPES
