Caracterização química e avaliação das atividades anti-herpética e citotóxica de polissacarídeos do fungo Agaricus brasiliensis Wasser

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em BiotecnologiaAgaricus brasiliensis (syn A. subrufescens) é um fungo basidiomiceto nativo no Brasil, que apresenta paredes celulares ricas em polissacarídeos, tais como ?-(1?6)-(1?3)-glicanas nos corpos de frutificação e ?-(1?2)-glico-?-(1?3)-mananas no micélio. Neste trabalho, estes polissacarídeos foram isolados e modificados quimicamente gerando seus respectivos derivados sulfatados. Os polissacarídeos nativos (FR e MI) e sulfatados (FR-S e-MI-S) foram caracterizados quimicamente e avaliados quanto as suas atividades citotóxica e anti-herpética in vitro. Uma vez que FR-S e MI-S apresentaram uma promissora ação anti-HSV-1 (cepas KOS e 29-R) e anti-HSV-2 (cepa 333), seu mecanismo de ação foi determinado. A atividade anti-herpética in vivo do MI-S também foi testada utilizando-se modelos murinos de infecção ocular, cutânea e genital. FR-S e MI-S apresentaram duas novas bandas de absorção no espectro de infravermelho em 1253 e 810 cm-1, relacionados aos grupamentos C-S-O e S=O, respectivamente. A massa molecular do FR e MI foram estimados em 609 e 310 kDa, respectivamente. FR-S (127 kDa) e MI-S (86 kDa) apresentaram massas reduzidas provavelmente devido a hidrólise ocorrida durante a reação de sulfatação. FR-S e MI-S apresentaram ~14% de enxofre na análise elementar. Análise de RMN de 1H e 13C confirmaram as estruturas mencionadas anteriormente para FR e MI, sendo o FR-S totalmente sulfatado em C-4 e C-6, enquanto o MI-S parcialmente sulfatado em C-2, C-3, C-4 e C-6. Embora FR e MI não terem apresentado atividade, FR-S e MI-S exibiram promissora ação anti-HSV, com índices de seletividade (SI=CC50/EC50) superiores a 208. FR-S e MI-S não tiveram efeito virucida, mas significativamente inibiram a adsorção e penetração, provavelmente por interagir com glicoproteínas virais. Estudos de combinação revelaram que FR-S e MI-S atuam de forma sinérgica com o aciclovir. Além disso, MI-S inibiu a expressão das proteínas virais ICP27, UL42, gB e gD. Não foi observada toxicidade nos grupos de animais não infectados e tratados com MI-S. O tratamento tópico e oral com MI-S não foi efetivo na redução da doença ocular. A aplicação tópica de MI-S nas lesões cutâneas também não foi efetiva, mas os animais infectados cutaneamente e tratados oralmente com MI-S mostraram redução significativa dos escores da doença e cura acelerada das lesões pelo HSV-1 após o nono dia. A administração vaginal de MI-S (500 µg), 20 min antes do desafio viral, significantemente reduziu os escores da doença (dias 5 a 9), títulos virais (dias 1 e 3) e mortalidade em comparação aos grupos controles. A sulfatação aumentou em 5X o efeito citotóxico do FR contra células tumorais A549, enquanto foi essencial para a atividade do MI. A combinação de fatores como o alto grau de substituição e a massa molecular relativamente menor teve impacto positivo sobre a atividade citotóxica do FR-S e MI-S. Os resultados mostram que o MI-S tem potencial a ser utilizado na redução da severidade das lesões cutâneas pelo HSV-1 e principalmente como um microbicida evitando a transmissão sexual das infecções genitais pelo HSV-2. Ainda, os resultados promissores obtidos na triagem preliminar estimulam novos estudos para avaliação do mecanismo da atividade citotóxica do MI-S e FR-S

Serum from dengue virus-infected patients with and without plasma leakage differentially affects endothelial cells barrier function <i>in vitro</i>

<div><p>Background</p><p>Although most of cases of dengue infections are asymptomatic or mild symptomatic some individuals present warning signs progressing to severe dengue in which plasma leakage is a hallmark.</p><p>Methodology/Principal findings</p><p>The present study used Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS^®) which allows for electrical monitoring of cellular barrier function measuring changes in Transendothelial Electric Resistance (TEER) to investigate the parameters associated with dengue induced leakage. Three groups of individuals were tested: dengue-positives with plasma leakage (leakage), dengue-positives without plasma leakage (no leakage), and dengue-negatives (control). Data show that TEER values of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) was significantly lower after incubation with serum from subjects of the leakage group in comparison to the no leakage or control groups. The serum levels of CXCL1, EGF, eotaxin, IFN-γ, sCD40L, and platelets were significantly decreased in the leakage group, while IL-10, IL-6, and IP-10 levels were significantly increased. We also found a strong correlation between TEER values and augmented levels of IP-10, GM-CSF, IL-1α, and IL-8, as well as decreased levels of CXCL1 and platelets.</p><p>Conclusions/Significance</p><p>The present work shows that the magnitude of the immune response contributes to the adverse plasma leakage outcomes in patients and that serum components are important mediators of changes in endothelial homeostasis during dengue infections. In particular, the increased levels of IP-10 and the decreased levels of CXCL1 and platelets seem to play a significant role in the disruption of vascular endothelium associated with leakage outcomes after DENV infection. These findings may have important implications for both diagnostic and therapeutic approaches to predict and mitigate vascular permeabilization in those experiencing the most severe clinical disease outcomes after dengue infection.</p></div

Serum albumin levels.

<p>Albumin levels of serum from the three different groups: Healthy blood donors (control, n = 13), DENV infected patients without leakage (no leakage, n = 13), or DENV infected patients with leakage (leakage, n = 13) were quantified by the bromocresol purple method. Groups were compared by the ANOVA/Tukey’s test. *Statistically significant difference (<i>p</i><0.05).</p

Effect of serum from DENV-positive patients on TEER of endothelial cells.

<p>Confluent monolayers of HUVECs cultured in ECIS arrays were treated or not with 10% serum from three different groups: Healthy blood donors (control, n = 13), DENV infected patients without leakage (no leakage, n = 13), or DENV infected patients with leakage (leakage, n = 13). (*) Asterisks indicate statistically significant differences (ANOVA/ Tukey’s test) between groups with <i>p</i><0.05. TEER values were obtained at 30 (A) and 120 (B) min after treatment.</p

Real-time impedance measurement throughout 5 h after treatment.

<p>Confluent monolayers of HUVECs cultured in ECIS arrays were treated or not with 10% serum from three different groups: Healthy blood donors (control, n = 13), DENV infected patients without leakage (no leakage, n = 13), or DENV infected patients with leakage (leakage, n = 13). Graph A shows results from the first experiment and graph B from the second experiment.</p

Comparison of immune components levels in serum from control, no leakage, and leakage groups.

<p>Comparison of immune components levels in serum from control, no leakage, and leakage groups.</p

Clinical and laboratory data of study participants.

<p>Clinical and laboratory data of study participants.</p