Testing endosymbiont-mediated immune protection in a novel host species

Tese de mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015The complexity of life forms cannot be explained without the concept of symbiosis. Symbiotic relations exist abundantly in nature, particularly the ones between bacteria and eukaryotic hosts. One of the most widespread endosymbiotic bacteria described belongs to the genus Wolbachia, naturally infecting arthropods and nematodes. In arthropods, Wolbachia induces reproductive manipulations, to promote infected female’s fitness as they are vertically transmitted, maternally. Additionally, in Drosophila melanogaster, they have been shown to confer protection against viral infections. Being an obligatory vertically-transmitted endosymbiont, Wolbachia phylogeny should recapitulate that of its hosts. However, several studies show that host and symbiont phylogenies are not concordant, suggesting that horizontal transfers must have occurred throughout time. This has been confirmed, namely between parasitoid wasps and their hosts. Considering these observations, the present project aimed at uncovering if and at which rate horizontal transmission of Wolbachia could occur between Drosophila melanogaster and its natural parasitoid Leptopilina boulardi. Also, we tested if the viral protection phenotype induced in Drosophila would be passed on to the novel host, after this horizontal transfer event. Simultaneously we screened a wild-caught population of Leptopilina heterotoma for Wolbachia presence. We obtained infected individuals with which we established an isofemale line and derived Wolbachia-negative counterparts using antibiotic treatment. With this tool, we characterized the effects of Wolbachia presence upon viral systemic infection. Our results show that horizontal transmission of Wolbachia happens between Leptopilina boulardi and its host, but the infection is not stably maintained. We also see that these wasps do not appear to be susceptible to viruses that are pathogenic in Drosophila (specifically DCV and FHV) and appear to be mildly Detrimental to Wolbachia-infected Leptopilina heterotoma. Finally, we have verified that a natural endosymbiont infection appears to delay full development time in Leptopilina heterotoma, although no effect is detected for longevity. With this work we have established an experimental system for the controlled and systematic study of the complex interactions between Drosophila, parasitoid wasps, Wolbachia and viruses.A diversidade de formas devida dificilmente é explicada sem ser tido em conta o conceito de simbiose. Relações simbióticas são abundantemente encontradas em ambientes naturais. Os primeiros eventos de endossimbiose conhecidos terão ocorrido há cerca de 1,5 milhares de milhão de anos atrás. Estes acontecimentos descrevem a incorporação de cianobactérias e proteobactérias ancestrais em organismos procariotas. Quando a simbiose se tornou mutualista obrigatória, estes organismos procariotas associados a endossimbiontes tornaram-se nos primeiros eucariotas do planeta, e os seus anteriormente designados endossimbiontes tornaram‐se organelos, nomeadamente cloroplastos e mitocôndrias. Atualmente existem incontáveis exemplos de organismos vivos que não existiriam se não se estabelecessem relações simbióticas entre diferentes entidades biológicas, constituindo a base para a enorme diversidade de formas de vida existentes. Alguns dos casos mais frequentes de interações entre diferentes organismos que moldam inquestionável e determinantemente a história evolutiva do planeta são os que ocorrem entre procariotas e hospedeiros eucariotas. Estes sistemas podem ser encontrados em todas As circunstâncias, quer em metazoários como plantas e animais, quer em organismos unicelulares. Por exemplo, o filo Porífera realiza incontáveis associações com microrganismos bacterianos que lhe permitem obter nutrientes mais eficazmente ou ainda os vários casos de plantas que formam associações com bactérias fixadoras de azoto. Numa tentativa de classificar os diferentes tipos de interações que podem ocorrer entre dois ou mais organismos, foram atribuídos nomes a categorias discretas que ocorrem no espectro de interações naturais possíveis. Relações simbióticas podem ser comensais, mutualistas ou parasíticas. Comensalismo descreve o tipo de interações em que um organismo beneficia da relação que desenvolve com outro, enquanto o segundo permanece indiferente. Relações mutualistas englobam situações em que a associação é mutualmente benéfica para ambos os envolvidos. Parasitismo implica que um dos envolvidos seja prejudicado, para benefício do outro. Estas duas últimas formas de interação estão intimamente relacionadas, na medida em que as medidas de adaptação que um endossimbionte tem de sofrer para poder invadir e colonizar um hospedeiro, qualquer que seja a interações que acabe por vingar, são semelhantes para uma relação mutualista ou parasita, especialmente se considerarmos as relações abundantes que se estabelecem entre bactérias e hospedeiros eucariotas. No entanto, e apesar das referidas classificações existirem e serem relevantes, é difícil atribuir qualidades discretas a endossimbiontes, uma vez que os efeitos que induzem no seu hospedeiro podem variar entre mutualistas ou patogénicos, consoante vários aspectos (como factores ambientais). Um exemplo privilegiado deste tipo de comportamento variável é o das bactérias do género Wolbachia. Estas são alfa-proteobactérias, membros do grupo Rickettsiales (que engloba todos as bactérias endossimbióticas obrigatórias conhecidas), que infectam artrópodes e algumas espécies de nematodes filariais. Este endossimbionte é um dos mais representados na natureza, infectando mais de 60% de todos os insectos conhecidos, para além de presente em ácaros, aranhas, escorpiões e isópodes. Sendo um dos organismos mais bem estudados atualmente no que diz respeito a relações de simbiose, existem vários estudos que descrevem algumas das adaptações que sofreu de modo a proliferar nas células dos hospedeiros. Nomeadamente, a bactéria utiliza mecanismos de transporte vesicular para viajar dentro das células do hospedeiro. No entanto, a característica deste género que é indubitavelmente mais estudada é a sua capacidade de manipular o sistema reprodutivo do hospedeiro em seu proveito. Existem diferentes formas segundo as quais Wolbachia consegue manipular a reprodução dos seus hospedeiros, nomeadamente: feminização, morte de machos, partenogénese e incompatibilidade citoplasmática (IC). Feminização descreve a transformação fenotípica em fêmeas de organismos geneticamente masculinos; morte de machos acontece quando machos infectados são inviabilizados, disponibilizando mais recursos para as irmãs que possam transmitir a infecção à geração seguinte; partenogénese descreve a produção de prole unicamente feminina contribuição parental masculina; por fim, a manipulação reprodutiva mais comum, a IC descreve o processo segundo o qual fêmeas infetadas geram menos prole viável quando fertilizadas por machos não infetados (ou se ambos hospedarem estirpes incompatíveis). Todos estes processos de manipulação reprodutiva têm como objectivo maximizar a dispersão e colonização de Wolbachia pelo maior número de indivíduos possível, o que por sua vez é conseguido através do favorecimento da descendência feminina. O principal motivo que explica estes processos prende‐se com a forma canónica de transmissão de Wolbachia entre hospedeiros, que é feita verticalmente por via materna. Uma outra influência que Wolbachia exerce sobre os seus hospedeiros prende‐se com a capacidade de proteger Drosophila melanogaster contra (algumas) infeções por vírus de RNA. Esta capacidade foi descrita recentemente (não só para Drosophila mas também para o mosquito Culex pipiens) e desde então múltiplos trabalhos têm sido desenvolvidos na tentativa de caracterizar e determinar os mecanismos subjacentes. É sabido que Wolbachia protege contra Drosophila C Virus (DCV) e Flock House Virus (FHV), entre outros vírus de RNA, mas que a proteção não se estende para vírus de DNA (que não se conhece infectarem naturalmente espécies de Drosophila) e que, inclusive, diferentes níveis de proteção estão associados a diferentes estirpes da bactéria. Outra peculiaridade deste género de endossimbiontes prende-se com a filogenia discordante que apresentam relativamente à dos seus hospedeiros. Tendo em conta que são verticalmente transmitidas, seria de esperar que a árvore filogenética das estirpes de Wolbachia espelhasse, com alguma exatidão, a árvore filogenética dos seus respetivos hospedeiros. Isto não se verifica sugerindo que, além da transmissão vertical, eventos de transmissão horizontal entre hospedeiros têm de ter ocorrido ao longo do tempo. Adicionalmente, estudos baseados nestas filogenias de Wolbachia permitem inferir que existem enormes semelhanças entre as estirpes albergadas por certos insectos filogeneticamente distantes, nomeadamente entre vespas parasitoides e os seus respectivos hospedeiros. Tendo isto em conta, foram conduzidos estudos que determinaram que a bactéria pode ser transmitida horizontalmente entre diferentes hospedeiros por canibalismo de animais infectados, por partilha próxima de nichos ecológicos e através de um vector como uma vespa parasitóide. Reunindo toda a informação apresentada acima, das características da Wolbachia, especificamente da sua capacidade de induzir proteção viral em Drosophila, da sua filogenia discordante (indicativa de eventos de transmissão horizontal) e da existência de casos reportados em que vespas parasitoides atuam como vector transportador de endossimbiontes, formulámos as questões que apresentamos de seguida. 1- Consegue a Wolbachia conferir proteção viral num hospedeiro parasitoide recem-adquirido, fruto de um evento de transmissão horizontal? 2- Está uma população natural de vespas parasitoides protegida contra infecções virais, pela sua estirpe nativa de Wolbachia? 2.1- Como responde esta população natural, em comparação com as vespas mantidas no laboratório? 2.2- Existem custos associados à manutenção de Wolbachia? Começámos por tentar responder à primeira questão estabelecendo linhas isogénicas da vespa Leptopilina boulardi não infectadas por Wolbachia e sujeitando-as a hospedeiros de Drosophila melanogaster contendo Wolbachia. Utilizando duas linhas de moscas infectadas com estirpes individuais diferentes, sujeitámos as vespas a estes hospedeiros infectados e recolhemos toda a descendência após este evento de parasitação. Com estas fêmeas estabelecemos linhas isogénicas, das quais recolhemos, na geração seguinte, indivíduos suficientes que nos permitisse extrair DNA e testar a presença de Wolbachia por PCR. Com estes dados pudemos inferir a taxa de transmissão horizontal entre Leptopilina boulardi e Drosophila melanogaster. Numa tentativa de avaliar se a proteção viral conferida em mosca era transmitida com o endossimbionte para o novo hospedeiro estabelecemos um protocolo de infecção viral sistémica em vespa. No entanto, verificámos que a espécie Leptopilina boulardi não parece ser susceptível aos vírus de RNA que são canonicamente testados em Drosophila. Atestámos também que, nesta espécie, uma transmissão horizontal de Wolbachia não origina uma infecção estável, que seja em última análise, verticalmente mantida. Para responder à questão 2, recolhemos indivíduos da natureza e testámos a presença de Wolbachia assim como determinámos a espécie em questão. Deparamo-nos com uma linha de Leptopilina heterotoma, infectada com Wolbachia. Para estabelecermos um controlo negativo, usámos um tratamento de antibiótico que tratou a infecção, proporcionando duas linhas semelhantes de vespa, uma com e outra sem Wolbachia. Posteriormente, infecção viral foi realizada para esta espécie, onde vimos um efeito pequeno da ação de DCV, apenas detectável na linha que continha a infecção bacteriana de origem mas não na linha tratada. Para determinar custos, realizámos ainda medições quanto ao tempo total de desenvolvimento e longevidade de ambas as linhas de Leptopilina heterotoma, onde detectámos um possível efeito da Wolbachia a atrasar ligeiramente o desenvolvimento de ovo até adulto. Sumariamente, os nossos resultados indicam que a transmissão horizontal de Wolbachia ocorre, embora o estabelecimento de uma infeção vertical estável seja seja, neste caso, indetectável. Concluímos também acerca do efeito que uma infecção viral pode ter (ou não) sobre uma espécie com a qual provavelmente partilha nichos ecológicos na natureza (considerando que tanto Leptopilina boulardi como Leptopilina heterótoma são parasitoides naturais de Drosophila melanogaster, o hospedeiro por excelência de DCV). Podemos ainda verificar que a presença deste endossimbionte pode induzir custos num hospedeiro nativo, como de resto é verificado noutras espécies

Voice pathologies : the most comum features and classification tools

Speech pathologies are quite common in society, however the exams that exist are invasive, making them uncomfortable for patients and depending on the experience of the clinician who performs the assessment. Hence the need to develop non-invasive methods, which allow objective and efficient analysis. Taking this need into account in this work, the most promising list of features and classifiers was identified. As features, jitter, shimmer, HNR, LPC, PLP, and MFCC were identified and as classifiers CNN, RNN and LSTM. This study intends to develop a device to support medical decision, however this article already presents the system interface.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Cured database of sustained speech parameters for chronic laryngitis pathology

This paper reports the construction and organization of a database of speech parameters extracted from a speech sound database. The database is freely available on internet and the paper intends also theirs advertise for the research community. The database includes the parameters extracted from the sound of sustained vowels produced by a group of Chronic Laryngitis patients and a group of control subjects with similar characteristics concerning gender and age. The set of parameters of this database consists in the Jitter, Shimmer, Harmonic to Noise Ratio (HNR), Noise to Harmonic Ratio (NHR) and Autocorrelation extracted from the sound of sustained vowels /a/, /i/ and /u/ at low, neutral and high tones.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Acoustic analysis of chronic laryngitis - statistical analysis of sustained speech parameters

This paper describes the statistical analysis of a set of features extracted from the speech of sustained vowels of patients with chronic laryngitis and control subjects. The idea is to identify which features can be useful in a classification intelligent system to discriminate between pathologic and healthy voices. The set of features analysed consist in the Jitter, Shimmer Harmonic to Noise Ratio (HNR), Noise to Harmonic Ratio (NHR) and Autocorrelation extracted from the sound of a sustained vowels /a/, /i/ and /u/ in a low, neutral and high tones. The results showed that besides the absolute Jitter, no statistical significance exist between male and female voices, considering the classification between pathologic or healthy. Any of the analysed parameters is likely to be a statistical difference between control and Chronic Laryngitis groups. This is an important information that these features can be used in an intelligent system to classify healthy from Chronic Laryngitis voices.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Classification of control/pathologic subjects with support vector machines

The diagnosis of pathologies using vocal acoustic analysis has the advantage of been noninvasive and inexpensive technique compared to traditional technique in use. In this work the SVM were experimentally tested to diagnose dysphonia, chronic laryngitis or vocal cords paralysis. Three groups of parameters were experimented. Jitter, shimmer and HNR, MFCCs extracted from a sustained vowels and MFCC extracted from a short sentence. The first group showed their importance in this type of diagnose and the second group showed low discriminative power. The SVM functions and methods were also experimented using the dataset with and without gender separation. The best accuracy was 71% using the jitter, shimmer and HNR parameters without gender separation.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Long short term memory on chronic laryngitis classification

The classification study with the use of machine learning concepts has been applied for years, and one of the aspects in which this can be applied is for the analysis of speech acoustics applied to the analysis of pathologies. Among the pathologies present, one of them is chronic laryngitis. Thus, this article aims to present the results for a classification of chronic laryngitis with the use of Long Short Term Memory as a classifier. The parameters of relative jitter, relative shimmer and autocorrelation was used as input of the LSTM. A dataset of about 1500 instances were used to train, validate and test along 4 experiments with LSTM and one feedforward Artificial Neural Network (ANN). The results of the LSTM overcome the ones of the feedforward ANN, and was about 100% accuracy, sensitivity and specificity in test set, denoting a promising future for this classification tool in the voice pathologies diagnose.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Harmonic to noise ratio measurement - selection of window and length

Harmonic to Noise Ratio (HNR) measures the ratio between periodic and non-periodic components of a speech sound. It has become more and more important in the vocal acoustic analysis to diagnose pathologic voices. The measure of this parameter can be done with Praat software that is commonly accept by the scientific community has an accurate measure. Anyhow, this measure is dependent with the type of window used and its length. In this paper an analysis of the influence of the window and its length was made. The Hanning, Hamming and Blackman windows and the lengths between 6 and 24 glottal periods were experimented. Speech files of control subjects and pathologic subjects were used. The results showed that the Hanning window with the length of 12 glottal periods gives measures of HNR more close to the Praat measures.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Estratégias usadas por alunos do 7º ano na resolução de tarefas estatísticas

O presente artigo é baseado num estudo desenvolvido ao longo do estágio curricular e centra-se no estudo das estratégias de resolução usadas por alunos do 7º ano de escolaridade em tarefas estatísticas envolvendo os conceitos de média, moda e mediana. Este estudo foi desenvolvido numa turma do 7º ano de escolaridade, com 19 alunos, e recorreu-se ao trabalho de grupo, a tarefas abertas e a discussões coletivas como metodologias de ensino-aprendizagem. Os dados usados no estudo foram obtidos a partir de diversos métodos: inicialmente, os alunos resolveram uma ficha de avaliação diagnóstica apenas sobre conteúdos estatísticos; de seguida, recolheram-se todas as produções escritas dos alunos durante toda a intervenção, gravando em vídeo ainda todas as aulas; e, por fim, os alunos resolveram uma ficha de avaliação sobre as medidas de tendência central. Em termos de resultados, identificaram-se neste estudo, cinco tipos de estratégias de resolução: estratégia de tentativa-e-erro; estratégia de compensação; estratégia de representação gráfica; estratégia aritmética e, por fim, estratégia algébrica

Parameters for vocal acoustic analysis - cured database

This paper describes the construction and organization of a database of speech parameters extracted from a speech database. This article intends to inform the community about the existence of this database for future research. The database includes parameters extracted from sounds produced by patients distributed among 19 diseases and control subjects. The set of parameters of this database consists of the jitter, shimmer, Harmonic to Noise Ratio (HNR), Noise to Harmonic Ratio (NHR), autocorrelation and Mel Frequency Cepstral Coefficients (MFCC) extracted from the sound of sustained vowels /a/, /i/ and /u/ at the high, low and normal tones, and a short German sentence. The cured database has a total number of 707 pathological subjects (distributed by the various diseases) and 194 control subjects, in a total of 901 subjects.info:eu-repo/semantics/publishedVersio