Charakterisierung der Lokalisation von Prestin (SLC26A5) in Membran-Mikrodomänen

Prestin (SLC26A5; Pres) nimmt eine Schlüsselstellung für die Funktion des SäugetierInnenohres ein. Es ist das Motorprotein der ÄHZ (Zheng et al. 2000), welches in Antwort auf Änderungen des Membranpotenzials ultraschnelle Längenänderungen der ÄHZ generiert (Brownell et al. 1985). Es wird angenommen, dass dieser als Elektromotilität bezeichnete Vorgang die Grundlage des elektro-mechanischen Verstärkerprozesses der ÄHZ darstellt und für die außerordentliche Sensitivität des Gehörs sorgt (Liberman et al. 2002). Der Verlust des Verstärkermechanismus der ÄHZ ist die häufigste Ursache von Schwerhörigkeit beim Menschen. Immunolokalisationen von nativem Pres zeigen eine subzelluläre Lokalisation in der lateralen Plasmamembran der ÄHZ (Winter et al. 2006). Die vorliegende Arbeit charakterisiert mittels verschiedener hoch auflösender FluoreszenzMikroskopie-Techniken die spezifische subzelluläre Lokalisation der Pres-Orthologen aus Wanderratte (Rattus norvegicus; rPres), Zebrafisch (Danio rerio; zPres) und Huhn (Gallus gallus; cPres) im heterologen Expressionssystem. Alle Pres-Orthologen offenbarten eine plasmamembran-ständige Lokalisation, jedoch Unterschiede in der Membran-Verteilung. Pres-Proteine aus Huhn wiesen eine homogene Verteilung auf. Die Orthologen aus Zebrafisch und Wanderratte hingegen lokalisierten als mikroskopisch sichtbare, fokale Cluster. Als eine molekulare Determinante dieser differenziellen Lokalisation wurde die TransmembranDomäne (TMD) von Pres identifiziert, d.h., die intrinsischen Eigenschaften der TMD sind für das Verteilungsverhalten von Pres ursächlich. Weiterhin wurde herausgefunden, dass die biophysikalischen Bedingungen der Plasmamembran das Clustering ebenfalls beeinflussen: So wurde gezeigt, dass die Verteilung von Pres vom Cholesterol-Gehalt der Zellen und der Temperatur abhängig ist. Darüber hinaus wird die Verteilung von Pres durch Proteine mitbestimmt. Das mikrodomänenassoziierte Cav-1 ko-lokalisierte mit Pres und induzierte einerseits das Clustering von cPres, war andererseits aber für die Lokalisation als Cluster nicht essentiell. Das Pres-Clustering war eng mit dem Zytoskelett assoziiert. So ko-lokalisierten Aktin- wie auch Map1S-Punkte mit den Pres-Clustern. Eine Depolymerisation des Aktin-Zytoskeletts löste die Cluster partiell auf. Heterolog exprimiertes Map1S verhinderte diese Auflösung. Biochemisch wurde abschließend gezeigt, dass Aktin und Cav-1 mit Pres cholesterol-abhängig interagieren. Zusammenfassend liegt Pres bei heterologer Expression in cholesterol-reichen und zytoskelettabhängigen lipid-raft-artigen Membran-Domänen als Protein-Komplex mit Cav-1, Aktin und Map1S vor. Die vorliegende Arbeit ermöglichte es, molekularen Eigenschaften der Pres-Membran-Domäne zu identifizieren und zeigt Kandidaten auf, die das Motorprotein der ÄHZ in der lateralen Membran organisieren könnten. Diese Kandidaten können an der Regulation der Elektromotilität beteiligt sein

A human phospholipid phosphatase activated by a transmembrane control module

In voltage-sensitive phosphatases (VSPs), a transmembrane voltage sensor domain (VSD) controls an intracellular phosphoinositide phosphatase domain, thereby enabling immediate initiation of intracellular signals by membrane depolarization. The existence of such a mechanism in mammals has remained elusive, despite the presence of VSP-homologous proteins in mammalian cells, in particular in sperm precursor cells. Here we demonstrate activation of a human VSP (hVSP1/TPIP) by an intramolecular switch. By engineering a chimeric hVSP1 with enhanced plasma membrane targeting containing the VSD of a prototypic invertebrate VSP, we show that hVSP1 is a phosphoinositide-5-phosphatase whose predominant substrate is PI(4,5)P(2). In the chimera, enzymatic activity is controlled by membrane potential via hVSP1\u27s endogenous phosphoinositide binding motif. These findings suggest that the endogenous VSD of hVSP1 is a control module that initiates signaling through the phosphatase domain and indicate a role for VSP-mediated phosphoinositide signaling in mammals

Charakterisierung der Lokalisation von Prestin (SLC26A5) in Membran-Mikrodomänen

Prestin (SLC26A5; Pres) nimmt eine Schlüsselstellung für die Funktion des SäugetierInnenohres ein. Es ist das Motorprotein der ÄHZ (Zheng et al. 2000), welches in Antwort auf Änderungen des Membranpotenzials ultraschnelle Längenänderungen der ÄHZ generiert (Brownell et al. 1985). Es wird angenommen, dass dieser als Elektromotilität bezeichnete Vorgang die Grundlage des elektro-mechanischen Verstärkerprozesses der ÄHZ darstellt und für die außerordentliche Sensitivität des Gehörs sorgt (Liberman et al. 2002). Der Verlust des Verstärkermechanismus der ÄHZ ist die häufigste Ursache von Schwerhörigkeit beim Menschen. Immunolokalisationen von nativem Pres zeigen eine subzelluläre Lokalisation in der lateralen Plasmamembran der ÄHZ (Winter et al. 2006). Die vorliegende Arbeit charakterisiert mittels verschiedener hoch auflösender FluoreszenzMikroskopie-Techniken die spezifische subzelluläre Lokalisation der Pres-Orthologen aus Wanderratte (Rattus norvegicus; rPres), Zebrafisch (Danio rerio; zPres) und Huhn (Gallus gallus; cPres) im heterologen Expressionssystem. Alle Pres-Orthologen offenbarten eine plasmamembran-ständige Lokalisation, jedoch Unterschiede in der Membran-Verteilung. Pres-Proteine aus Huhn wiesen eine homogene Verteilung auf. Die Orthologen aus Zebrafisch und Wanderratte hingegen lokalisierten als mikroskopisch sichtbare, fokale Cluster. Als eine molekulare Determinante dieser differenziellen Lokalisation wurde die TransmembranDomäne (TMD) von Pres identifiziert, d.h., die intrinsischen Eigenschaften der TMD sind für das Verteilungsverhalten von Pres ursächlich. Weiterhin wurde herausgefunden, dass die biophysikalischen Bedingungen der Plasmamembran das Clustering ebenfalls beeinflussen: So wurde gezeigt, dass die Verteilung von Pres vom Cholesterol-Gehalt der Zellen und der Temperatur abhängig ist. Darüber hinaus wird die Verteilung von Pres durch Proteine mitbestimmt. Das mikrodomänenassoziierte Cav-1 ko-lokalisierte mit Pres und induzierte einerseits das Clustering von cPres, war andererseits aber für die Lokalisation als Cluster nicht essentiell. Das Pres-Clustering war eng mit dem Zytoskelett assoziiert. So ko-lokalisierten Aktin- wie auch Map1S-Punkte mit den Pres-Clustern. Eine Depolymerisation des Aktin-Zytoskeletts löste die Cluster partiell auf. Heterolog exprimiertes Map1S verhinderte diese Auflösung. Biochemisch wurde abschließend gezeigt, dass Aktin und Cav-1 mit Pres cholesterol-abhängig interagieren. Zusammenfassend liegt Pres bei heterologer Expression in cholesterol-reichen und zytoskelettabhängigen lipid-raft-artigen Membran-Domänen als Protein-Komplex mit Cav-1, Aktin und Map1S vor. Die vorliegende Arbeit ermöglichte es, molekularen Eigenschaften der Pres-Membran-Domäne zu identifizieren und zeigt Kandidaten auf, die das Motorprotein der ÄHZ in der lateralen Membran organisieren könnten. Diese Kandidaten können an der Regulation der Elektromotilität beteiligt sein

A human phospholipid phosphatase activated by a transmembrane control module

In voltage-sensitive phosphatases (VSPs), a transmembrane voltage sensor domain (VSD) controls an intracellular phosphoinositide phosphatase domain, thereby enabling immediate initiation of intracellular signals by membrane depolarization. The existence of such a mechanism in mammals has remained elusive, despite the presence of VSP-homologous proteins in mammalian cells, in particular in sperm precursor cells. Here we demonstrate activation of a human VSP (hVSP1/TPIP) by an intramolecular switch. By engineering a chimeric hVSP1 with enhanced plasma membrane targeting containing the VSD of a prototypic invertebrate VSP, we show that hVSP1 is a phosphoinositide-5-phosphatase whose predominant substrate is PI(4,5)P(2). In the chimera, enzymatic activity is controlled by membrane potential via hVSP1\u27s endogenous phosphoinositide binding motif. These findings suggest that the endogenous VSD of hVSP1 is a control module that initiates signaling through the phosphatase domain and indicate a role for VSP-mediated phosphoinositide signaling in mammals