Quantification of mitochondrial DNA in human whole blood using real- time quantitative PCR

Las variaciones en el contenido de mtDNA se han asociado con diferentes situaciones patológicas. Su determinación en sangre es un parámetro de interés pero se ve afectado por numerosas variables. El objetivo del presente proyecto es analizar la influencia de estas variables de cara a establecer un protocolo eficiente y reproducible. La PCR a tiempo real es una técnica que se está aplicando ampliamente en las ciencias biomédicas para la cuantificación de DNA tanto mitocondrial como genómico. En este estudio trabajamos con sangre total para cuantificar el DNA mitocondrial, calculado como el ratio DNA mitocondrial/DNA nuclear. Hemos iniciado el estudio de diferentes variables que pueden afectar a dicha cuantificación. Así, se ha comprobado que la concentración de plaquetas, orgánulos que contienen DNA mitocondrial pero no DNA nuclear, afecta de forma significativa en la determinación final. De igual modo hemos estudiado la influencia que produce en la cuantificación el método de extracción utilizado para obtener el DNA y la variabilidad inter-día e intra-día en el método de extracción. Se han encontrado diferencias significativas en todas estas variables. Para realizar estos análisis hemos creado un plásmido fruto de la fusión de nuestros genes de estudio (mitocondrial y nuclear) con el fin de realizar una calibración de las medidas mediante una recta de calibrado realizada con diluciones seriadas de este estándar. También hemos estudiado la influencia de la conformación del material genético en la eficacia de la reacción de PCR y se ha visto que, puesto que al digerir el DNA mitocondrial con una enzima la cuantificación de DNA mitocondrial se ve aumentada. En la continuación del proyecto queremos seguir clarificando las fuentes de variabilidad que afectan a la técnica de PCR a tiempo real en la cuantificación de DNA mitocondrial

La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales

La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Las mitocondrias son orgánulos subcelulares cuya función principal es la generación de ATP a través del sistema de fosforilación oxidativa OXPHOS; sin embargo, éste no es el único papel de las mitocondrias, ya que participan en numerosas rutas metabólicas, intervienen en procesos intracelulares y generan la mayor parte de las especies reactivas de oxígeno (ROS). Las enfermedades causadas por defectos en los genes del sistema OXPHOS, están catalogadas como enfermedades raras y actualmente no existen tratamientos eficaces para tratar estas enfermedades, por lo que entre los posibles tratamientos que se están investigando está el uso de terapia génica para tratar las enfermedades mitocondriales. El grupo GENOXPHOS, en el cual he realizado el proyecto Máster, ha desarrollado un modelo de ratón knock-in para la proteína AOX, bajo la influencia del promotor Rosa26 que hace que su expresión sea constitutiva y ubicua. Dicha proteína está presente en plantas y algunos eucariotas inferiores pero ausente en mamíferos y su expresión es capaz de revertir en células en cultivo un fenotipo defectuoso causado por fallos OXPHOS, por lo que su expresión en modelos animales con mutaciones en los complejos III y IV de la cadena de transporte electrónico mitocondrial podría paliar los efectos fenotípicos de la mutación en los descendientes. En este proyecto se ha propuesto completar el análisis de los ratones knock-in y ensayar in vivo la terapia génica basada en la xenoexpresión y se ha demostrado que dicha proteína, se puede expresar en células de mamíferos, se dirige a la mitocondria y además es funcional. Estos resultados nos llevan a pensar que AOX puede tener una posible utilidad terapéutica en las enfermedades mitocondriales

Terapia génica de las enfermedades mitocondriales mediante xenoexpresión de la oxidasa alternativa AOX

La oxidasa alternativa (AOX) está presente en numerosos organismos, como hongos, plantas, protistas y metazoos, pero no en mamíferos. Su función de transportar electrones desde el ubiquinol hasta el O2, permitiendo saltar desde el complejo I hasta el aceptor final de electrones sin pasar por la parte de la cadena dependiente de citocromos (complejos III y IV). Así, previene prevendría la producción excesiva de especies reactivas de oxígeno (ROS) y restablece el transporte de electrones cuando falta un componente de la cadena. La disfunción de la cadena de transporte de electrones y la sobreproducción de ROS causan diversas patologías humanas, que van desde las enfermedades neurodegenerativas hasta el cáncer, y pueden ser fundamentales en el envejecimiento. Por este motivo en este proyecto se ha tratado de restablecer el flujo de electrones y prevenir la sobreproducción de ROS mediante la xenoexpresión de AOX en ratones con disfunciones mitocondriales por defectos en el complejo IV (citocromo oxidasa o COX). Sin embargo, AOX podría producir efectos perjudiciales en mamíferos por el posible efecto desacoplante que disiparía la energía. Por este motivo se realizó la caracterización funcional del ratón KI AOX, y se observó que la expresión de AOX no afecta a los principales parámetros fisiológicos. Además, se inició la terapia génica de enfermedades causadas por defectos en el complejo IV (COX10 y COX15) mediante xenoexpresión de AOX, en la que se obtuvieron resultados muy variados, aunque con una tendencia hacia la mejora. En conclusión, estos resultados indican que la expresión de AOX en el ratón es inocua y puede permitir una compensación del fenotipo patológico, aunque por el momento no se han obtenido resultados concluyentes. Así, la expresión de AOX podría representar una valiosa herramienta para contrarrestar una amplia variedad de enfermedades mitocondriales originadas por defectos en la fosforilación oxidativa

Estudio del papel de los supercomplejos respiratorios y los ROS en los procesos de tumorigénesis y metástasis

El sistema de fosforilación oxidativa, presente en la membrana interna de la mitocondria, es el encargado de producir la mayor parte de la energía metabólica en células eucariotas. En el proceso de transformación tumoral, las células modifican su metabolismo hacia la degradación anaeróbica de glucosa en detrimento de la respiración mitocondrial. Esto suele ir acompañado de un aumento en los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS), que actúan como mutágenos y mitógenos. Estos ROS presentan una clara relación recíproca con los SCs respiratorios, que ha comenzado a estudiarse recientemente en los procesos oncogénicos y metastásicos. En este contexto, nos proponemos estudiar el papel de los SCs y los ROS en los procesos tumorales y metastásicos, trabajando con tres líneas celulares de cáncer de mama con diferentes capacidades de invasión. Con este objetivo principal hemos estudiado la funcionalidad de su sistema OXPHOS y el patrón de ensamblaje de los supercomplejos respiratorios. También se determinaron los niveles de ROS y la capacidad detoxificadora de las células y, por último, se evaluaron los efectos en el mtDNA y la biogénesis mitocondrial. Los resultados indican que las células más invasivas tienen una deficiencia en la funcionalidad de su sistema OXPHOS y una menor formación de supercomplejos, siendo el patrón de organización distinto en cada línea celular. La línea más metastásica también presenta unos elevados niveles de ROS, mientras que las células de estadio intermedio cuentan con una mayor defensa antioxidante. Además, conforme aumenta la capacidad de invasión de las células observamos una disminución del número de copias de mtDNA y de biogénesis mitocondrial.<br /

Efecto fenotípico de variantes polimórficas del mtDNA

La extensa variabilidad de secuencia del mtDNA humano se ha considerado durante años como el resultado de sustituciones neutras acumuladas a lo largo de la evolución a causa de la deriva genética. Las asociaciones de los haplotipos mitocondriales con diversos fenotipos entre los que se encuentran la motilidad espermática o la longevidad, han hecho cambiar esta idea. La influencia de las variantes polimórficas del mtDNA sobre la función OXPHOS ha sido demostrada en células transmitocondriales humanas y de ratón. Los ratones complásticos, portadores del mtDNA de una estirpe en el entorno nuclear de otra, constituyen una herramienta de estudio muy útil para trasladar los estudios de variabilidad genética mitocondrial a organismos completos. En este TFG se han evaluado distintos parámetros relacionados con la función mitocondrial en muestras procedentes de ratones NZB y su correspondiente línea complástica portadora del mtDNA de C57 (CN: NZBmtC57) que había sido generada previamente en el grupo GENOXPHOS con el objetivo de confirmar los resultados obtenidos en líneas transmitocondriales. Los resultados obtenidos nos indican que el haplotipo del mtDNA modifica la función OXPHOS a pesar de que existe una respuesta compensatoria de aumento de la biogénesis mitocondrial mediada probablemente por ROS

Efecto de factores ambientales sobre los supercomplejos respiratorios en procesos tumorales

El sistema OXPHOS, que se encuentra en la membrana interna de la mitocondria, es el encargado de la síntesis de ATP en la célula eucariota mediante la fosforilación oxidativa. Sin embargo, las células tumorales sufren una serie de modificaciones en su metabolismo energético aumentando su tasa glucolítica y la producción de lactato. Esta bioenergética desregulada es la responsable principal de una mayor generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) en la cadena de transporte electrónico (ETC) que influyen en la organización molecular de los complejos respiratorios en la formación de supercomplejos (SCs). Las ROS son capaces de inducir la vía intrínseca de la apoptosis mitocondrial pero también pueden actuar como mitógenos ya que contribuyen a la formación y proliferación de tumores neoplásicos. Las células tumorales también sufren mutaciones en su mtDNA, modificaciones en su temperatura intracelular, sobreexpresión de factores inhibidores de la ATP sintasa y sobreexpresión de enzimas antioxidantes que afectan a la proliferación tumoral en los estadios iniciales del tumor y condicionan su posterior evolución.En este trabajo hemos analizado la influencia de la mitocondria en el proceso tumoral empleando líneas transmitocondriales procedentes de células epiteliales de cáncer de mama generadas en el laboratorio. Hemos estudiado la función y organización del sistema OXPHOS y la producción y detoxificación de ROS. Los resultados demuestran que estas líneas tumorales presentan deficiencias estructurales y funcionales en el sistema OXPHOS que se pueden relacionar con un aumento en la producción de ROS que parece inducir un incremento en la biogénesis mitocondrial como mecanismo compensatorio.<br /

Efecto de factores ambientales sobre los supercomplejos respiratorios en procesos tumorales. Revisión bibliográfica

Las células cancerosas adoptan un metabolismo basado en la glicólisis aeróbica con elobjetivo de obtener la energía e intermediarios necesarios para el crecimiento y proliferacióntumoral; es lo que se denomina “efecto Warburg”. En esta reestructuración, la mitocondriajuega un papel principal a través del sistema OXPHOS, siendo efectores esenciales las especiesreactivas de oxígeno (ROS) que se generan en la cadena de transporte electrónico (ETC). EstasROS son segundos mensajeros en distintas rutas de señalización que contribuyen al desarrollodel tumor. Las células tumorales también incrementan la producción de antioxidantes, evitandoque las ROS alcancen niveles citotóxicos dañando, entre otras moléculas, a los complejos ysupercomplejos (SCs) mitocondriales.Dada la importancia de la mitocondria y de la ETC en el desarrollo tumoral, se buscadesarrollar tratamientos que los tengan como diana, entre los que destacan la hipertermia y eluso de fármacos. En cuanto a la aplicación de temperatura, hipertermias medias alteran lasinteracciones entre lípidos y los SCs. Temperaturas algo superiores producen, además, lapermeabilización de la membrana, desacoplando el transporte electrónico del gradiente de H+.Se pierde la homeostasis del Ca++, regulador de los SCs, y disminuyen las defensas antioxidantes.Como consecuencia, las ROS alcanzan niveles citotóxicos y se da la muerte celular. Estos últimosaños se buscan fármacos cuya diana sea la ETC. Un ejemplo es la metformina, que inhibe el CIreduciendo el flujo de la ETC y por tanto la producción de ATP, así como de ROS. Como resultado,se detienen los procesos de consumo de ATP como la síntesis de intermediarios, necesarios parala proliferación celular, y las ROS caen a niveles por debajo de los mínimos tumorigénicos.<br /

La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales

La proteína AOX como terapia génica para enfermedades mitocondriales. Las enfermedades mitocondriales constituyen un amplio grupo de patologías que se caracterizan por presentar alteraciones en la cadena de transporte de electrones, con la consiguiente disminución de la producción de energía en forma de ATP. El tratamiento de las enfermedades mitocondriales presenta una serie de dificultades y, de hecho, no existe una terapia efectiva para tratarlas. Actualmente, las medidas terapéuticas se limitan a ser de soporte en la gran mayoría de los pacientes. Una de las terapias que se está investigando en la actualidad consiste en la xenoexpresión de la oxidasa alternativa AOX, enzima procedente del hongo Emericella nidulans. En concreto, en el presente trabajo de fin de máster se ha continuado con la caracterización de dicha proteína, realizando ensayos de inmunodetección de AOX en distintos tejidos de ratón knock-in, y ensayos de viabilidad para estudiar la funcionalidad de la proteína. Los ensayos de inmunodetección revelaron que AOX se expresa en todos los tejidos de ratón analizados y que su expresión es mayor en ratones machos. Sin embargo, no se pudo concluir el origen de las tres bandas correspondientes a AOX. Además, los ensayos de viabilidad demostraron que no ejerce ningún efecto cuando se produce un fallo en la cadena a nivel del complejo I, al contrario de lo que sucedía con los complejos III y IV, validando la relevancia funcional de dicha proteína

How hot can mitochondria be? Incubation at temperatures above 43 °C induces the degradation of respiratory complexes and supercomplexes in intact cells and isolated mitochondria

Mitochondrial function generates an important fraction of the heat that contributes to cellular and organismal temperature maintenance, but the actual values of this parameter reached in the organelles is a matter of debate. The studies addressing this issue have reported divergent results: from detecting in the organelles the same temperature as the cell average or the incubation temperature, to increasing differences of up to 10 degrees above the incubation value. Theoretical calculations based on physical laws exclude the possibility of relevant temperature gradients between mitochondria and their surroundings. These facts have given rise to a conundrum or paradox about hot mitochondria. We have examined by Blue-Native electrophoresis, both in intact cells and in isolated organelles, the stability of respiratory complexes and supercomplexes at different temperatures to obtain information about their tolerance to heat stress. We observe that, upon incubation at values above 43 °C and after relatively short periods, respiratory complexes, and especially complex I and its supercomplexes, are unstable even when the respiratory activity is inhibited. These results support the conclusion that high temperatures (>43 °C) cause damage to mitochondrial structure and function and question the proposal that these organelles can physiologically work at close to 50 °C

Papel del Complejo IV sobre el ensamblaje y estabilidad de los complejos y supercomplejos respiratorios

El correcto funcionamiento del sistema OXPHOS depende del ensamblaje y actividad de cada uno de los complejos de la cadena de transporte electrónico. Por tanto, cualquier mutación que afecte a la integridad de éstos, se reflejará en la funcionalidad de este sistema. La estabilidad de los diferentes complejos no es aislada, sino que se han descrito relaciones de interdependencia entre ellos para formar los supercomplejos respiratorios y llevar a cabo la respiración celular. En este TFG, se ha estudiado el efecto de las variaciones en el complejo IV sobre el ensamblaje y función de los complejos y supercomplejos respiratorios. Para ello hemos utilizado como modelo líneas celulares con distintos porcentajes de la mutación C6247T en la subunidad Cox1 del complejo IV codificada en el DNA mitocondrial (mtDNA). Esta mutación induce un cambio de aminoácido que impide el correcto ensamblaje de la citocromo c oxidasa provocando un déficit de este complejo. De esta manera, conseguimos líneas celulares con un rango de carga mutacional que nos permitirá comprobar hasta qué punto la célula sigue manteniendo la actividad OXPHOS y el ensamblaje de supercomplejos. Los ensayos para estudiar la presencia de asociaciones de supercomplejos respiratorios y la actividad del sistema revelaron que incluso con altos porcentajes de heteroplasmia (hasta un 87% de mtDNA mutado), la célula es capaz de mantener buenos niveles de funcionalidad y supervivencia. Esto puede deberse a mecanismos de compensación por parte de la célula ante el déficit en el complejo IV