Study of GBF1-Arf signaling pathway during viral replication

Depuis une décennie, GBF1 a émergé comme étant un facteur cellulaire essentiel à la réplication de plusieurs virus à ARN de polarité positive (ARN(+)), issus de différentes familles. GBF1 est un facteur d’échange nucléotidique de petites protéines G de la famille Arf, connu pour son action régulatrice des étapes précoces de la voie de sécrétion. En étudiant le virus de l’hépatite C (VHC) comme virus modèle, nous avons montré que le rôle de GBF1 dans la réplication virale est distinct de sa fonction régulatrice de la voie de sécrétion. En effet,GBF1 participe à la réplication du VHC par l’intermédiaire de la paire Arf4 et Arf5, alors que c’est la paire Arf1et Arf4 qui est impliquée dans la voie sécrétion. Pour déterminer si ce mécanisme d’action est conservé parmi les virus à ARN(+), nous avons d’abord montré que GBF1 est impliquée dans l’infection par le virus de la fièvre jaune (YFV), le virus sindbis (SINV), le coronavirus 229E humain (HCoV-229E) et le coxsackievirus B4(CVB4). Puis, nos résultats indiquent que les infections YFV, SINV et HCoV-229E dépendent, tout comme le VHC, des protéines Arf4 et Arf5. Toutefois, le YFV et le SINV utiliseraient également une autre paire d’Arf,Arf1 et Arf4, lors de leur cycle viral. Par ailleurs, l’infection par le coxsackievirus B4 (CVB4) est dépendante de GBF1 mais ne semble pas dépendre des protéines Arf. Bien que GBF1 soit un facteur crucial pour la réplication des virus ARN(+), son mécanisme d’action ne semble donc pas être conservé.La paire Arf4-Arf5 semble impliquée dans la réplication de plusieurs virus à ARN(+). Cependant, ces deux Arf ont été très peu étudiées, contrairement à la protéine Arf1. Nous faisons l’hypothèse que la paire Arf4-Arf5 agit en régulant une série d’effecteurs spécifiques qui sont importants pour la réplication virale. Nos résultats montrent que la déplétion simultanée de Arf4 et de Arf5 perturbe la morphologie de l’appareil de Golgi, qui devient condensé, et des gouttelettes lipidiques (GL), qui s’accumulent et grossissent en périphérie cellulaire.Toutefois, une analyse lipidomique de cellules déplétées de Arf4 et Arf5 montre une composition lipidique inchangée, ce qui suggère un effet sur la morphologie des GL et non pas sur le métabolisme des lipides. Une analyse transcriptomique nous a permis de mettre en évidence une série de protéines, dont l’expression est modulée, suite à la déplétion de Arf4 et Arf5. Nous avons évalué l’implication potentielle de certaines d’entre elles dans l’infection du VHC, mais aucune ne s’est révélée importante pour ce virus. En conclusion, nos résultats ont permis de mettre en évidence de nouvelles fonctions de GBF1, médiées par la paire de protéines Arf4 et Arf5. Arf4 et Arf5 sont impliquées dans la régulation de la morphologie de l’appareil de Golgi et des GL ainsi que dans la réplication de plusieurs virus à ARN(+). Il reste à évaluer si ces fonctions sont indépendantes les unes des autres ou liées entre elles et quels effecteurs spécifiques elles font intervenir.GBF1 has recently emerged as a cellular factor essential for the replication of single-stranded positive-sense RNA ((+)RNA) viruses from different families. GBF1 is a guanine-nucleotide exchange factor of small G proteins of the Arf family, known to regulate the early secretory pathway. By studying the hepatitis C virus (HCV) as a model, we have shown that the role of GBF1 in viral replication is distinct from its regulatoryfunction of the sercretory pathway. Indeed, GBF1 function in HCV replication is mediated by Arf4 and Arf5,whereas another pair, Arf1 and Arf4, mediates the regulation of the secretion. To determine if this mechanism ofaction is conserved among (+)RNA viruses, we showed that GBF1 is involved in yellow fever virus (YFV),sindbis virus (SINV), human coronavirus 229E (HCoV-229E) and coxsackievirus B4 (CVB4) infection. Our results indicate that YFV, SINV and HCoV-229E infections are Arf4 and Arf5 dependent, as we previouslyshowed for HCV. However, YFV and SINV would also use another Arf pair, Arf1 and Arf4, during their lifecycle. In addition, CVB4 infection depends on GBF1, but doesn’t seem to depend on any Arf. Although GBF1 is required for (+)RNA viruses replication, its mechanism of action appears not to be conserved.The Arf4-Arf5 pair appears to be involved in the replication of several (+)RNA viruses. However, these twoproteins have been poorly studied so far, contrary to Arf1. Our hypothesis is that the Arf4-Arf5 pair regulatesspecific effectors involved in viral replication. Our results indicate that Arf4 and Arf5 simultaneous depletionalters the morphology of the Golgi apparatus, which becomes condense, and of lipid droplets (LD), whichaccumulate and grow bigger at the cell periphery. However, a lipidomic analysis of Arf4 and Arf5 depleted cellsdisplayed an unaltered lipid composition, which suggests a morphologic impact on LD, rather than a disruptionof the lipid metabolism. A transcriptomic analysis identified proteins up- or down-regulated after Arf4 and Arf5 depletion. We assessed the function of some of these proteins in HCV replication, but none of them proved implicated.In conclusion, our results hightlighed new GBF1 functions, mediated by the pair Arf4-Arf5. Arf4 and Arf5 are involved in regulating the morphology of Golgi complex and of LDs, as well as the replication of (+) RNA viruses. It remains to assess if these functions are independent or related to each other, and which specific effectors they use

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Investigation of the role of GBF1 in the replication of positive-sense single-stranded RNA viruses

International audienceGBF1 has emerged as a host factor required for the replication of positive-sense single-stranded RNA viruses of different families, but its mechanism of action is still unknown. GBF1 is a guanine nucleotide exchange factor for Arf family members. Recently, we identified Arf4 and Arf5 (class II Arfs) as host factors required for the replication of hepatitis C virus (HCV), a GBF1-dependent virus. To assess whether a GBF1/class II Arf pathway is conserved among positive-sense single-stranded RNA viruses, we investigated yellow fever virus (YFV), Sindbis virus (SINV), coxsackievirus B4 (CVB4) and human coronavirus 229E (HCoV-229E). We found that GBF1 is involved in the replication of these viruses. However, using siRNA or CRISPR-Cas9 technologies, it was seen that the depletion of Arf1, Arf3, Arf4 or Arf5 had no impact on viral replication. In contrast, the depletion of Arf pairs suggested that class II Arfs could be involved in HCoV-229E, YFV and SINV infection, as for HCV, but not in CVB4 infection. In addition, another Arf pair, Arf1 and Arf4, appears to be essential for YFV and SINV infection, but not for infection by other viruses. Finally, CVB4 infection was not inhibited by any combination of Arf depletion. We conclude that the mechanism of action of GBF1 in viral replication appears not to be conserved, and that a subset of positive-sense single-stranded RNA viruses from different families might require class II Arfs for their replication

Identification of class II ADP-ribosylation factors as cellular factors required for hepatitis C virus replication

International audienceGBF1 is a host factor required for hepatitis C virus (HCV) replication. GBF1 functions as a guanine nucleotide exchange factor for G‐proteins of the Arf family, which regulate membrane dynamics in the early secretory pathway and the metabolism of cytoplasmic lipid droplets. Here we established that the Arf‐guanine nucleotide exchange factor activity of GBF1 is critical for its function in HCV replication, indicating that it promotes viral replication by activating one or more Arf family members. Arf involvement was confirmed with the use of two dominant negative Arf1 mutants. However, siRNA‐mediated depletion of Arf1, Arf3 (class I Arfs), Arf4 or Arf5 (class II Arfs), which potentially interact with GBF1, did not significantly inhibit HCV infection. In contrast, the simultaneous depletion of both Arf4 and Arf5, but not of any other Arf pair, imposed a significant inhibition of HCV infection. Interestingly, the simultaneous depletion of both Arf4 and Arf5 had no impact on the activity of the secretory pathway and induced a compaction of the Golgi and an accumulation of lipid droplets. A similar phenotype of lipid droplet accumulation was also observed when GBF1 was inhibited by brefeldin A. In contrast, the simultaneous depletion of both Arf1 and Arf4 resulted in secretion inhibition and Golgi scattering, two actions reminiscent of GBF1 inhibition. We conclude that GBF1 could regulate different metabolic pathways through the activation of different pairs of Arf proteins