Estudo do mecanismo de ação antiproliferativa e antitumoral de extratos de Casearia sylvestris e de fenilaminonaftoquinonas associadas ou não ao ascorbato de sódio

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2014.Casearia sylvestris é uma planta utilizada popularmente no tratamento de tumores. Quinonas tratam-se de compostos que apresentam significativo efeito antitumoral. Evidências indicam que o efeito antineoplásico de quinonas pode ser elevado pela associação destas com o ascorbato de sódio (ASC). Desta forma, este trabalho tem como objetivo avaliar os mecanismos envolvidos nos efeitos antiproliferativo e antitumoral mediados pelo extrato bruto (EB-ETOH) e frações de Casearia sylvestris, bem como pelas fenilaminonaftoquinonas 7 (Q7) e 9 (Q9) administradas isoladamente ou em associação ao ascorbato de sódio. A análise fitoquímica demonstrou a presença de casearina C na fração clorofórmica (f-CHCl3) e EB-ETOH de C. sylvestris. EB-ETOH e f-CHCl3, apresentaram importante citotoxicidade sobre células MCF-7. Quando administrados em doses subtóxicas (= CI20), EB-ETOH e f-CHCl3 exerceram atividade antiproliferativa sobre células MCF-7, sendo capazes de promover a parada do ciclo celular em G1, devido ao aumento da expressão de p53 e p16, bem como da redução da expressão de CDK2. Além disso, os extratos elevaram a fosforilação de ?H2Ax. EB-ETOH e f-CHCl3 apresentaram significativa atividade antitumoral in vivo em camundongos isogênicos Balb-C portadores do tumor sólido de Ehrlich, reduzindo a razão área da massa tumoral/área do osso em torno de 18 e 40%, respectivamente. Q7 e Q9 mostraram citotoxicidade seletiva sobre células T24, a qual foi potencializada pela associação destes compostos a ASC (CI50 Q7 = 27,1; CI50 Q9 = 44,3; CI50 Q7 + ASC = 14,5; CI50 Q9 + ASC= 16,9 µM). Fenilaminonaftoquinonas (10 µM) isoladas ou associadas à ASC não foram capazes de promover a ativação de caspases e a clivagem da PARP, sugerindo-se que o mecanismo de morte induzido pelas associações trata-se de necrose, visto que ambos tratamentos promoveram lise celular. Q7, Q9, Q7 + ASC e Q9 + ASC reduziram a proliferação de células T24 em torno de 29,7; 3,5; 36,7 e 88,8 %, respectivamente Além disso, fenilaminonaftoquinonas associadas ao ASC modificaram o número de células presentes na fase G2/M e elevaram a atividade da ß-galactosidase ácida, sugerindo que tais tratamentos são capazes de induzir senescência. Os efeitos citotóxico e antiproliferativo promovidos pela associação de fenilaminonaftoquinonas ao ASC envolve modificações na sinalização mediada por MAPKs. Os resultados obtidos permitem sugerir que tanto a associação de fenilaminonaftoquinonas ao ASC, quanto os extratos deC. sylvestris tratam-se de promissores coadjuvantes na terapêutica do câncer quando administrados juntamente a agentes citotóxicos.Abstract : The branches and leafs of Casearia sylvestris tree has medicinal properties comproved through ethnobotanical surveys reporting plant extracts has being used in traditional therapy as first approaches to several conditions, including cancer. Evidences indicate that quinones antineoplastic effect could be raised up through sodium ascorbate association (ASC). Thus, this study aims to evaluate some mechanisms related to in vitro antiproliferative and antitumor effects mediated by C. sylvestris ethanol crude extract (EB-EtOH) and fractions, as well mediated only by synthetic phenylaminonaphthoquinones or co-administered with ASC. EB-EtOH and its chloroformic fraction (f-CHCl3) had casearin C, a clerodane diterpene with chemopreventive activity. Consequently, both extracts showed significant cytotoxicity over MCF-7 cells. Furthermore, using subtoxic concentrations (= IC20), EB - EtOH and f-CHCl3 exerted antiproliferative activity on MCF - 7 cells, being able to promote cell cycle arrest in G1 due to increased expression of p53 and p16, as well as reducing CDK2 expression. Additionally, these extracts were still able to increase the ?H2Ax expression. EB-EtOH and f-CHCl3 had significant in vivo antitumor activity throught Ehrlich carcinoma-bearing Balb-c mice model causing reduction in the ratio tumor over bone area about 18 and 40 %, respectively. On the other hand, synthetic phenylaminonaphthoquinone 7 (Q7) and phenylaminonaphthoquinone 9 (Q9) showed selective cytotoxicity for T24 cells, which enhanced in the ASC presence (IC50 Q7 = 27.1; IC50 Q9 = 44.3; IC50 Q7 + ASC = 14.5; IC50 Q9 + ASC = 16.9 µM). Take into account that both phenylaminonaphthoquinones (10 µM) isolated or associated with ASC were not able to activate caspase 3 or PARP cleavage, ours results suggest that necrosis occurs instead apoptosis as cell death mechanism possible induced by the ASC association, since both treatments showed cytolytic effect. Q7, Q9, Q7 + ASC and Q9 + ASC reducing cell proliferation about 29.7; 3.5; 36.7 and 88.8%, respectively. Besides, phenylaminonaphthoquinones associated with ASC augment G2 / M phase cells and also increase acid ß-galactosidase activity, suggesting senescence induction capability. Moreover, cytotoxic and antiproliferative effects promoted by the ASC association involves changes in MAPK signaling pathways. These results suggest that C. sylvestris extracts and the association between phenylaminonaphthoquinones and ASC are promising adjuvants incancer therapy and could be administered together with conventional quimioterapic agents

Estudo da atividade antitumoral do extrato bruto e frações de Casearia sylvestris

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2010O desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas, como as terapias que utilizam as plantas medicinais, tem despertado grande interesse no tratamento do câncer, pois as terapias disponíveis não são capazes de regredir totalmente a evolução da patologia e/ou apresentam elevada toxicidade. A C. sylvestris, planta medicinal que possui vários usos populares no Brasil e outros paises americanos, tem sido indicada para o tratamento de tumores. Nesse contexto, o presente trabalho propôs avaliar as atividades citotóxica, antiproliferativa, pró-apoptótica, antiangiogênica e antitumoral do extrato bruto (EB-ETOH), e das frações metanólica (f-MeOH), acetato de etila (f-AcOEt) e clorofórmica (f-CHCl3) de Casearia sylvestris utilizando modelos experimentais in vitro e in vivo. Nos ensaios do MTT e incorporação de timidina triciada realizados respectivamente, para investigar a citotoxicidade e influência dos extratos sobre a proliferação celular, os resultados demonstraram que EB-ETOH, f-CHCl3 e f-AcOEt reduziram de maneira significativa a viabilidade e proliferação de células do carcinoma de Ehrlich, sendo a citotoxicidade promovida pelo tratamento com esses extratos, tempo e concentração dependente. Diante do efeito citotóxico promovido por EB-ETOH, f-CHCl3 e f-AcOEt sobre células do carcinoma de Ehrlich, avaliou-se o tipo de morte celular promovida pelos tratamentos. A coloração com brometo de etídeo/laranja de acridina (BE/LA) revelou que o provável tipo de morte celular induzida pelos tratamentos trata-se de apoptose, uma vez que a grande maioria das células, após terem entrado em contato com a referida solução corante, adquiriram uma coloração laranja-avermelhada, característica da ocorrência do fenômeno apoptótico. Entretanto, em relação à avaliação da atividade nucleásica, verificada através da realização do teste de dano ao DNA plasmidial, observou-se que os efeitos antiproliferativo e citotóxico induzidos por EB-ETOH, f-CHCl3 e f-AcOEt, não são mediados por uma interação e dano direto ao DNA. Além disso, a realização desse ensaio permitiu observar que os extratos têm a capacidade de proteger o DNA do ataque induzido por EROs, excluindo-se portanto, a possibilidade de estarem exercendo seus efeitos citotóxico e antiproliferativo através da indução de estresse oxidativo no núcleo. As avaliações morfológicas e bioquímicas realizadas nas amostras obtidas de camundongos portadores do tumor ascítico de Ehrlich mostraram que os animais tratados com EB-ETOH e f-CHCl3 apresentaram menor ganho de peso corporal (26 e 31%, respectivamente) e de circunferência abdominal (52 e 58%, respectivamente), menor volume de líquido ascítico (46 e 43%, respectivamente), aumento do percentual de longevidade (48 e 40%, respectivamente) e da proporção de células inviáveis/viáveis (70 e 78%, respectivamente), quando comparados ao grupo controle negativo. Com a realização do modelo in vivo do TAE, observou-se ainda que o efeito antitumoral promovido por esses extratos é dose-dependente, uma vez que se apresentou-maior, quanto mais elevada a concentração de extrato administrada ao animal. A realização do ensaio do CAM, permitiu verificar que tanto o EB-ETOH, como f-CHCl3 de C. sylvetris, exercem um significativo efeito antiangiogênico, de maneira dose-dependente, onde a administração de 3,25; 7,5 e 15 µg/disco de EB-ETOH e f-CHCl3 foram capazes de diminuir o percentual de vasos, em torno de 54,5; 61,4 e 71% e 42,1; 59,1 e 70,9%, respectivamente. Por fim, cabe ressaltar que a realização da biometria dos embriões possibilitou observar que o tratamento dos mesmos com extrato bruto e fração clorofórmica não se apresentou tóxico, uma vez que não alterou o desenvolvimento embrionário nem a morfogênese externa, avaliados pelo comprimento total do embrião, razão comprimento cefálico/comprimento truncal e razão comprimento cefálico/comprimento total. Dessa forma, conclui-se que EB-ETOH e f-CHCl3 de C. sylvestris apresentaram efeito citotóxico, antiproliferativo, pró apoptótico e antitumoral in vitro e in vivo, sobre as células do carcinoma de Ehrlich. Tal efeito antitumoral mediado por esses extratos, não envolvem sua intercalação ao DNA, e sugere-se que se deva, pelo menos em parte, à inibição da formação de vasos e a conseqüente supressão nutricional das células tumorais

Potent hepatoprotective effect in CCl4-induced hepatic injury in mice of phloroacetophenone from Myrcia multiflora

Background: This study investigated the hepatoprotective effect and antioxidant properties of phloroacetophenone (2′,4′,6′-trihydroxyacetophenone – THA), an acetophenone derived from the plant Myrcia multiflora.Material & Method: The free radical scavenging activity in vitro and induction of oxidative hepatic damage by carbon tetrachloride (CCl4) (0.5 ml/kg, i.p.) were tested in male Swiss mice (25±5 g). Results: This compound exhibited in vitro antioxidant effects on FeCl2–ascorbate-induced lipid peroxidation (LPO) in mouse liver homogenate, scavenging hydroxyl and superoxide radicals, and 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl. The in vivo assays showed that THA significantly (p<0.01) prevented the increases of hepatic LPO as measured by the levels of thiobarbituric acid-reactive substances, mitochondrial swelling. It also protected hepatocytes against protein carbonylation and oxidative DNA damage. Consistent with these observations, THA pre-treatment normalized the activities of antioxidant enzymes, such as catalase, glutathione peroxidase, and superoxide dismutase, and increased the levels of reduced glutathione (GSH) in CCl4-treated mice. In addition, THA treatment significantly prevented the elevation of serum enzymatic activities of alanine amino transferase, aspartate amino transferase, and lactate dehydrogenase, as well as histological alterations induced by CCl4. Silymarin (SIL) (24 mg/kg), a known hepatoprotective drug used for comparison, led to a significant decrease (p<0.01) in activities of theses enzymes in way very similar to that observed in pre-treatment with THA. Conclusion: These results suggest that the protective effects are due to reduction of oxidative damage induced by CCl4 resulting from the antioxidant properties of THA

ESTUDO DA QUALIDADE DAS ÁGUAS DO RIO MAROMBAS (SC/BRASIL), UTILIZANDO PARÂMETROS FÍSICO-QUÍMICOS E BIOENSAIOS.

O presente trabalho propôs realizar estudos preliminares de avaliação da qualidade das águas do Rio Marombas (SC-Brasil), utilizando parâmetros físico-químicos e bioensaios. Amostras de águas do Rio Marombas foram coletadas em 3 pontos e realizada a determinação de pH, oxigênio dissolvido (OD), análise de agroquímicos, hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPA’s), compostos orgânicos voláteis (COV’s) e bifenilas policloradas (PCB’s). Foram executados ensaios de toxicidade aguda (CL50) em microcrustáceos Artemia sp. e de fitotoxicidade em Allium cepa L. avaliada pela inibição de crescimento e peso de raízes e pelos biomarcadores de estresse oxidativo glutationa reduzida (GSH) e peroxidação lipídica. Os resultados dos parâmetros físico-químicos indicaram que os valores de pHestiveram compatíveis com padrões previstos pela legislação. Foi constatada a presença dos agroquímicos metomil nos Pontos 1 e 2 e metconazol no Ponto 1. Os bioensaios revelaram que não houve toxicidade em Artemia sp. e ausência de inibição de crescimento e peso de raízes em Allium cepa L. A concentração de GSH estava significativamente aumentada no Ponto 3 quando comparada ao Ponto 1 e ao controle negativo. Não foi observada diferença significativa na avaliação de peroxidação lipídica entre os diferentes grupos. Esses resultados indicam que as águas do Rio Marombas podem estar sendo contaminadas por agroquímicos, sugerindo a necessidade de implementação de sistema de monitoramento periódico de sua qualidade.Palavras-chave: rio Marombas; parâmetros físico-químicos; bioensaiosSTUDY OF WATER QUALITY FROM THE MAROMBAS RIVER (SC/BRAZIL) USING THE PHYSICOCHEMICAL PARAMETERS AND BIOASSAYS.ABSTRACTThe present study proposed preliminary studies assessing the quality of water from the river Marombas (SCBrazil) using the physicochemical parameters and bioassays. Samples of water from Marombas river were collected at three points and it was determined the pH, dissolved oxygen (DO), concentration of agrochemicals, polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH’s), volatile organic compounds (VOC`s) and polychlorinated biphenyls (PCB´s). Acute toxicity tests (LC50) were carried out in microcrustaceans Artemia sp. and phytotoxicity tests in Allium cepa L. assessed through theinhibition of growth and weight of roots and by biomarkers of oxidative stress reduced glutathione (GSH) and lipid peroxidation. The results of physicochemical parameters indicated that the pH values were consistent with standards established by the legislation. It could be observed the presence of the agrochemicals methomyl in Points 1 and 2 and metconazole in Point 1. The bioassays showed absence of the acute toxicity in Artemia sp. and there was no inhibition of growth and weight of roots in Allium cepa L. The concentration of GSH was significantly increased (P<0.05) in Point 3 when compared to Point 1 and the negative control. No significant difference could be observed in the evaluation of lipid peroxidation between different groups. These results demonstrate that the water of the Marombas river is contaminated by agrochemicals, suggesting the necessity of implementing a system of monitoring its quality.Key words: Marombas river, physicochemical parameters, bioassay

Brazilian Bidens pilosa Linné yields fraction containing quercetin-derived flavonoid with free radical scavenger activity and hepatoprotective effects

Bidens pilosa is a plant used by Amazonian and Asian folks for some hepatopathies. The hydroethanol crude extract and three fractions were assessed for antioxidant and hepatoprotective effects. Higher levels of scavenger activity on the 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical, inhibition of deoxyribose oxidation and lipid peroxidation in vitro were detected for the ethyl acetate fraction (IC50~4.3–32.3 µg/ml) followed by the crude extract (IC50~14.2–98.0 µg/ml). The ethyl acetate fraction, again followed by the crude extract, showed high contents of total soluble polyphenols (3.6±0.2 and 2.1±0.2 GAE/mg, respectively) and presence of a quercetin-derived flavonoid identified as quercetin 3,3′-dimethyl ether 7-O-β-D-glycopyranoside. Both products were assayed for hepatoprotector effects against CCl4-induced liver injury in mice. Markers of oxidative stress and hepatic injury were evaluated. The results showed that the 10-day pretreatments (15 mg/kg, p.o.) protected the livers against injury by blocking CCl4-induced lipid peroxidation and protein carbonylation and the DNA fragmentation was decreased (~60%). The pretreatments avoided the loss of the plasma ferric reducing/antioxidant power and the elevation of serum transaminases and lactate dehydrogenase activities. The results suggest that the main constituents responsible for the hepatoprotective effects with free radical scavenger power associated are well extracted by performing fractionation with ethyl acetate. The findings support the Brazilian traditional use of this plant and justify further evaluations for the therapeutic efficacy and safety of the constituents of the ethyl acetate fraction to treat some liver diseases

Silencing of the transcription factors Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc or Nanog has different effect on teratoma growth

Induced pluripotent stem cells (iPSC) have a great potential, but their clinical application depends on finding strategies to abolish their tumorigenic potential. The use of Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc and Nanog to generate iPSC demonstrated the already known importance of these genes to maintain stemness. Therefore, the presence of these genes is responsible for iPSC-derived teratomas. Similar to iPSC, P19 teratocarcinoma cell line also has characteristics of embryonic carcinoma cells and the ability to differentiate into many cell types. We separately silenced the transcription factors Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc and Nanog in P19 cells and measured the impact of this silencing in vivo. All silenced cells generated tumors when injected in immunosuppressed mice, but silencing of Oct4, Sox2 and Klf4 generated mainly teratomas with mesoderm tissue. Our results suggest that downregulation of these transcription factors is not enough to avoid the formation of teratomas, but their silencing affect their differentiation potential.Fil: Villodre, Emilly Schlee. Universidade Federal do Rio Grande do Sul; BrasilFil: Felipe, Karina Bettega. Universidade Federal do Rio Grande do Sul; BrasilFil: Oyama, Mayumi Zanotta. Universidade Federal do Rio Grande do Sul; BrasilFil: de Oliveira, Francine Hehn. Universidade Federal do Rio Grande do Sul; BrasilFil: Lopez, Patrícia Luciana da Costa. Universidade Federal do Rio Grande do Sul; BrasilFil: Solari, Claudia María. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Sevlever, Gustavo. Fundación para la Lucha contra las Enfermedades Neurológicas de la Infancia; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Guberman, Alejandra Sonia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Lenz, G.. Universidade Federal do Rio Grande do Sul; Brasi