Degradación in vitro de Bouteloua repens por cultivos de R. flavefaciens y F. succinogenes aislados de ganado alimentado con pastos tropicales en Colombia

The capacity to degrade the cellular wall of Bouteloua repens of 12 isolates of Ruminococcus flavefaciens and 17 isolates of Fibrobacter succinogenes was determined. A procedure was developed to standardize both, the inoculum and the substrate concentration for in vitro incubations of pure culture isolates.The ruminal bacteria were isolated from either Bos indicus cattle from the Alto Magdalena region of Colombia, grazing Bouteloua repens, and Sanmartinero cows (a Colombian criollo breed) from the  eastern lowlands (Llanos Orientales) of Colombia, grazing Brachiara spp. The isolates identity was confirmed using molecular methods. All isolates of F. succinogenes showed a high capacity to degrade cell wall preparations of Bouteloua repens, than those of R. flavefaciens (P<0.0001).The effect of individual isolated on cell wall digestibility was also highly significant (P<0.0001). Native isolates surpassed considerably the reference strains of R. flavefaciens ATCC 19208 (12.83% vs. 6.83%) and F. succinogenes ATCC 19169 (13.77% vs. 7.94%) on their capacity to digest Bouteloua repens cellular wall.This difference was highly significant (p<0.05) for all isolates. Findings suggest that in tropical conditions native ruminal bacteria has developed a high capacity to degrade lignocellulose. Further research about the potential usefulness of specific inocula or enzyme extracts developed from such isolates in improving the degradability of low quality forages by cattle or what industrial applications can be improved by the use of these products.Se determinó la capacidad de degradación de la pared celular de Bouteloua repens de 12 aislados de Ruminococcus flavefaciens y 17 de Fibrobacter succinogenes. Se desarrolló un procedimiento para estandarizar la concentración, tanto del inóculo como de los sustratos, de las incubaciones in vitro de cultivos puros de los aislados. Las bactérias fueron aisladas del ganado Bos indicus, procedente de la región del Alto Magdalena, que pastoreaban Teatino (Bouteloua repens) y del ganado Sanmartinero (una raza nativa) procedente de los Llanos Orientales de Colombia, que pastoreaban Brachiaria spp. La identificación del aislado fue confirmada usando métodos moleculares. Todos los aislados de F. succinogenes mostraron mayor capacidad de degradación de las preparaciones de pared celular de Bouteloua repens que los de R. flavefaciens (P<0.0001). La capacidad de los aislados individuales para degradar la pared celular también difirió significativamente (P<0.0001). Los aislados nativos sobrepasaron considerablemente la capacidad para digerir la pared celular de Bouteloua repens de las cepas de referencia de R. flavefaciensATCC19208 (12.83% vs. 6.83%) y F. succinogenes ATCC19169 (13.77% vs. 7.94%), diferencia que fue altamente significativa (p<0.05) para todos los aislados. Los resultados sugieren que, en condiciones tropicales, las bacterias ruminales nativas tienen una alta capacidad para degradar la lignocelulosa. Se requiere mayor investigación sobre la utilidad potencial del inóculo o de extractos enzimáticos desarrollados a partir de tales aislados, a fin de aumentar la degradabilidad por el ganado de forrajes de baja calidad o para definir las aplicaciones industriales pueden ser mejoradas por el uso de estos productos.

Criopreservación de aislados nativos de la bacteria ruminal Fibrobacter succinogenes

In this study, the technique of cryopreservation in liquid nitrogen to preserve native isolates of the fibrolytic bacteria Fibrobacter succinogenes was standardized. The technique efficiency was evaluated by establishing the bacterium viability during one year. The Mac-Farland scale, widely used to estimate aerobic bacterial populations, was validated by the roll tube technique (R2=0.95). Two native F. succinogenes strains, C7 and C9, were used. These strains were obtained from cattle fed on Brachiaria decumbens in the eastern lowlands of Colombia. Fifteen days after the initiation of the cryopreservation process, a reduction in the number of viable bacteria (CFU ml-1) was registered (C7 from 9.25 x 108 to 6.15 x 108 and C9 from 12.51 x 108 to. 9.26 x 108). However, the bacterial populations did not present differences in subsequent samplings (C7=6.13 – 6.16X108, C9=9.26 – 9.35X108 CFU ml-1, range over a year). Results indicated that the tandardized cryopreservation technique is an effective and easy procedure to preserve ruminal bacteria, which would be a very useful tool to create a germplasm bank of Colombian ruminal anaerobic microorganisms. The criopreservation technique, and the MacFarland scale have an advantage over other methods of preserving bacteria and methods of estimating populations of bacteria by active cultures. The procedures used in this research are reliable and economical techniques using minimal storage spaces and laboratory resources.En el presente trabajo se estandarizó una técnica de criopreservación en nitrógeno líquido, usando como crioprotector dimetil sulfóxido al 5%, para la preservación de aislados nativos bacterianos de Fibrobacter succinogenes. El respectivo protocolo de criopreservación se evaluó determinando la viabilidad bacteriana por el transcurso de un año. La escala de MacFarland, ampliamente conocida en la estimación de poblaciones bacterianas aerobias, fue validada como técnica de estimación de bacterias anaerobias, usando la técnica de conteo bacteriano por roll-tube (R2 = 0.95). Se utilizaron dos aislados nativos, C7 y C9, de Fibrobacter succinogenes, obtenidos del rumen de bovinos en pastoreo de Brachiaria decumbens, en los Llanos Orientales de Colombia. Quince días después de la exposición de los cultivos al proceso de criopreservación, se apreció una reducción en el número de bacterias viables con relación a la población inicial de cada uno de los aislados (C7 = 9.25 x 108 UFCml-1 vs. 6.15 x 108 UFCml-1 y C9 = 12.51 x 108 UFCml-1 vs. 9.26 x 108 UFCml-1). Sin embargo, no se presentaron diferencias en la población de bacterias viables en los muestreos posteriores (C7 = 6.13 – 6.16 x 108; C9 = 9.26 – 9.35 x 108 UFCml-1). Esta técnica permite mantener la viabilidad bacteriana y puede considerarse como un procedimiento eficiente y de fácil aplicación para la preservación de bacterias ruminales. Además, constituye una herramienta fundamental para el establecimiento de bancos de germoplasma de microorganismos anaerobios ruminales en Colombia. El uso conjunto de las técnicas de criopreservación y la escala de MacFarland, posee ventajas sobre los métodos de preservación y estimación de poblaciones por cultivos activos, por su confiabilidad, eficiencia y bajo costo. 

Nla4 and Nla18, key regulatory proteins required for normal growth and development of Myxococcus xanthus

Changes in gene expression are important for the landmark morphological events that occur during M. xanthus fruiting body development. NtrC-like activators play a prominent role in the coordinated expression of developmental genes. Mutations in the ntrC -like activator genes nla4 and nla18 are known to affect the timing of fruiting body formation, the morphology of mature fruiting bodies, and the sporulation efficiency. In this study we show that early developmental gene expression is altered in the early stages of fruiting body development in nla4 and nla18 cells. Production of A-signal, a quorum-sensing signal required early in development, is severely affected. The earliest event in development, accumulation of the intracellular starvation signal ppGpp is reduced. Thus, there is an early and strong modification of the developmental program in nla4 and nla18 cells. Further studies revealed that nla4 cells fail to express normal levels of genes whose products are implicated in the regulation of ppGpp accumulation. Inactivation of nla4 reduces GTP accumulation, a precursor of (p)ppGpp, which also stimulates growth related processes in other bacteria. Furthermore, nla4 inactivation causes a dramatic decrease in the M. xanthus vegetative growth rate. It is likely that Nla4 is an important key in modulating (p)ppGpp accumulation by activating the expression of the stringent response related genes during the M. xanthus life cycle. This study shows that inactivation of nla18 produces a strong defect in M. xanthus vegetative growth. DNA microarray analysis revealed that the vegetative expression patterns of more than 700 genes are altered in nla18 cells. Among the largest classes of altered genes are those which code for putative membrane and membrane-associated proteins. Our findings show that the membrane protein profiles isolated from vegetative nla18 and wild-type cells are noticeably different. Inactivation of nla18 causes misexpression of many genes that are likely to be important for protein synthesis. It therefore appears that nla18 cells are unable to regulate genes that encode important components of the translational machinery, thereby affecting stringent response. Our data are consistent with a model in which Nla18 controls vegetative growth and development by regulating the expression of genes involved in protein synthesis and membrane structure

REVIEW: The rumen microbiome: composition, abundance, diversity, and new investigative tools

Ruminants are able to degrade and use fibrous feed as a source of energy and nutrients because of the presence of complex anaerobic microbiota in the rumen, composed mainly of bacteria, fungi, and ciliate protozoa. Ruminal microorganisms play different roles in feed digestion and act synergistically to ferment plant structural and nonstructural carbohydrates and proteins. This review reports the latest assessment of microbiota diversity in the rumen ecosystem and summarizes the molecular techniques and the newly available \u201comic\u201d technologies, based on DNA and RNA sequence analysis, which allow for new insights into the structure and functions of these complex microbial communities.Peer reviewed: YesNRC publication: Ye

Criopreservación de aislados nativos de la bacteria ruminal Fibrobacter succinogenes

In this study, the technique of cryopreservation in liquid nitrogen to preserve native isolates of the fibrolytic bacteria Fibrobacter succinogenes was standardized. The technique efficiency was evaluated by establishing the bacterium viability during one year. The Mac-Farland scale, widely used to estimate aerobic bacterial populations, was validated by the roll tube technique (R2=0.95). Two native F. succinogenes strains, C7 and C9, were used. These strains were obtained from cattle fed on Brachiaria decumbens in the eastern lowlands of Colombia. Fifteen days after the initiation of the cryopreservation process, a reduction in the number of viable bacteria (CFU ml-1) was registered (C7 from 9.25 x 108 to 6.15 x 108 and C9 from 12.51 x 108 to. 9.26 x 108). However, the bacterial populations did not present differences in subsequent samplings (C7=6.13 – 6.16X108, C9=9.26 – 9.35X108 CFU ml-1, range over a year). Results indicated that the tandardized cryopreservation technique is an effective and easy procedure to preserve ruminal bacteria, which would be a very useful tool to create a germplasm bank of Colombian ruminal anaerobic microorganisms. The criopreservation technique, and the MacFarland scale have an advantage over other methods of preserving bacteria and methods of estimating populations of bacteria by active cultures. The procedures used in this research are reliable and economical techniques using minimal storage spaces and laboratory resources.En el presente trabajo se estandarizó una técnica de criopreservación en nitrógeno líquido, usando como crioprotector dimetil sulfóxido al 5%, para la preservación de aislados nativos bacterianos de Fibrobacter succinogenes. El respectivo protocolo de criopreservación se evaluó determinando la viabilidad bacteriana por el transcurso de un año. La escala de MacFarland, ampliamente conocida en la estimación de poblaciones bacterianas aerobias, fue validada como técnica de estimación de bacterias anaerobias, usando la técnica de conteo bacteriano por roll-tube (R2 = 0.95). Se utilizaron dos aislados nativos, C7 y C9, de Fibrobacter succinogenes, obtenidos del rumen de bovinos en pastoreo de Brachiaria decumbens, en los Llanos Orientales de Colombia. Quince días después de la exposición de los cultivos al proceso de criopreservación, se apreció una reducción en el número de bacterias viables con relación a la población inicial de cada uno de los aislados (C7 = 9.25 x 108 UFCml-1 vs. 6.15 x 108 UFCml-1 y C9 = 12.51 x 108 UFCml-1 vs. 9.26 x 108 UFCml-1). Sin embargo, no se presentaron diferencias en la población de bacterias viables en los muestreos posteriores (C7 = 6.13 – 6.16 x 108; C9 = 9.26 – 9.35 x 108 UFCml-1). Esta técnica permite mantener la viabilidad bacteriana y puede considerarse como un procedimiento eficiente y de fácil aplicación para la preservación de bacterias ruminales. Además, constituye una herramienta fundamental para el establecimiento de bancos de germoplasma de microorganismos anaerobios ruminales en Colombia. El uso conjunto de las técnicas de criopreservación y la escala de MacFarland, posee ventajas sobre los métodos de preservación y estimación de poblaciones por cultivos activos, por su confiabilidad, eficiencia y bajo costo. 

Degradación in vitro de Bouteloua repens por cultivos de R. flavefaciens y F. succinogenes aislados de ganado alimentado con pastos tropicales en Colombia

The capacity to degrade the cellular wall of Bouteloua repens of 12 isolates of Ruminococcus flavefaciens and 17 isolates of Fibrobacter succinogenes was determined. A procedure was developed to standardize both, the inoculum and the substrate concentration for in vitro incubations of pure culture isolates.The ruminal bacteria were isolated from either Bos indicus cattle from the Alto Magdalena region of Colombia, grazing Bouteloua repens, and Sanmartinero cows (a Colombian criollo breed) from the  eastern lowlands (Llanos Orientales) of Colombia, grazing Brachiara spp. The isolates identity was confirmed using molecular methods. All isolates of F. succinogenes showed a high capacity to degrade cell wall preparations of Bouteloua repens, than those of R. flavefaciens (P<0.0001).The effect of individual isolated on cell wall digestibility was also highly significant (P<0.0001). Native isolates surpassed considerably the reference strains of R. flavefaciens ATCC 19208 (12.83% vs. 6.83%) and F. succinogenes ATCC 19169 (13.77% vs. 7.94%) on their capacity to digest Bouteloua repens cellular wall.This difference was highly significant (p<0.05) for all isolates. Findings suggest that in tropical conditions native ruminal bacteria has developed a high capacity to degrade lignocellulose. Further research about the potential usefulness of specific inocula or enzyme extracts developed from such isolates in improving the degradability of low quality forages by cattle or what industrial applications can be improved by the use of these products.Se determinó la capacidad de degradación de la pared celular de Bouteloua repens de 12 aislados de Ruminococcus flavefaciens y 17 de Fibrobacter succinogenes. Se desarrolló un procedimiento para estandarizar la concentración, tanto del inóculo como de los sustratos, de las incubaciones in vitro de cultivos puros de los aislados. Las bactérias fueron aisladas del ganado Bos indicus, procedente de la región del Alto Magdalena, que pastoreaban Teatino (Bouteloua repens) y del ganado Sanmartinero (una raza nativa) procedente de los Llanos Orientales de Colombia, que pastoreaban Brachiaria spp. La identificación del aislado fue confirmada usando métodos moleculares. Todos los aislados de F. succinogenes mostraron mayor capacidad de degradación de las preparaciones de pared celular de Bouteloua repens que los de R. flavefaciens (P<0.0001). La capacidad de los aislados individuales para degradar la pared celular también difirió significativamente (P<0.0001). Los aislados nativos sobrepasaron considerablemente la capacidad para digerir la pared celular de Bouteloua repens de las cepas de referencia de R. flavefaciensATCC19208 (12.83% vs. 6.83%) y F. succinogenes ATCC19169 (13.77% vs. 7.94%), diferencia que fue altamente significativa (p<0.05) para todos los aislados. Los resultados sugieren que, en condiciones tropicales, las bacterias ruminales nativas tienen una alta capacidad para degradar la lignocelulosa. Se requiere mayor investigación sobre la utilidad potencial del inóculo o de extractos enzimáticos desarrollados a partir de tales aislados, a fin de aumentar la degradabilidad por el ganado de forrajes de baja calidad o para definir las aplicaciones industriales pueden ser mejoradas por el uso de estos productos.

The Myxococcus xanthus Nla4 Protein Is Important for Expression of Stringent Response-Associated Genes, ppGpp Accumulation, and Fruiting Body Development▿ †

Changes in gene expression are important for the landmark morphological events that occur during Myxococcus xanthus fruiting body development. Enhancer binding proteins (EBPs), which are transcriptional activators, play prominent roles in the coordinated expression of developmental genes. A mutation in the EBP gene nla4 affects the timing of fruiting body formation, the morphology of mature fruiting bodies, and the efficiency of sporulation. In this study, we showed that the nla4 mutant accumulates relatively low levels of the stringent nucleotide ppGpp. We also found that the nla4 mutant is defective for early developmental events and for vegetative growth, phenotypes that are consistent with a deficiency in ppGpp accumulation. Further studies revealed that nla4 cells produce relatively low levels of GTP, a precursor of RelA-dependent synthesis of (p)ppGpp. In addition, the normal expression patterns of all stringent response-associated genes tested, including the M. xanthus ppGpp synthetase gene relA, are altered in nla4 mutant cells. These findings indicate that Nla4 is part of regulatory pathway that is important for mounting a stringent response and for initiating fruiting body development