Pesquisa de anticorpos contra agentes infecciosos em pacientes com doença coronariana

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Farmácia.Várias evidências sugerem que existe ligação entre infecções e doenças coronarianas. Estudos histopatológicos detectaram antígenos e material genético de vários microorganismos em lesões ateroscleróticas. Outros autores demonstraram associação entre anticorpos contra agentes infecciosos e doença arterial coronariana. Entretanto, o envolvimento de agentes infecciosos com aterosclerose precisa ser melhor esclarecido. O objetivo do presente estudo, foi avaliar títulos e presença de anticorpos (IgG, IgM) específicos contra vírus Herpes-1 (HSV-1), Citomegalovirus (CMV), Helicobacter pylori (H. pylori), Chlamydia pneumoniae (C. pneumoniae) e Mycoplasma pneumoniae (M. pneumoniae), no soro de 60 pacientes [40 com doença arterial coronariana (DAC) e 20 controles(C)], através de ELISA. Pacientes soropositivos (IgG) para Mycoplasma pneumoniae e aqueles com títulos mais elevados tiveram risco maior para ter DAC (odds ratio=20,4 IC 95% 1,97-507,47 e 13,0 IC 95% 1,65-131,6; respectivamente). Entre as diferentes síndromes de DAC, observamos que pacientes com angina instável apresentaram maior soropositividade de IgM contra H. pylori, que pacientes com angina estável (P=0,03), sugerindo um envolvimento entre infecção aguda por esse agente e a manifestação aguda da DAC. Os pacientes com angina estável apresentaram maior soropositividade de IgG contra M. pneumoniae que os controles (P=0,001). Esse fato sugere um envolvimento de infecção crônica por M. pneumoniae e início da DAC. Nenhuma associação foi observada entre anticorpos (IgM ou IgG) contra HSV-1, CMV e C. pneumoniae, e DAC. Quando avaliou-se a associação entre o número de patógenos aos quais o indivíduo tinha sido exposto (carga de patógenos) e DAC, não foi encontrado resultados significativos (odds ratio=3,05 IC 95% 0,67-15,73). Em resumo, esse estudo demonstrou associação entre infecção aguda por H. pylori (indicada pela presença de IgM) e angina instável e aumento do risco para ocorrer DAC nos pacientes com infecção crônica, ou passada por M. pneumoniae (indicada pela presença de IgG)

Serial Changes in Plasma Levels of Cytokines in Patients with Coronary Artery Disease

Roberto H Heinisch1, Carlos R Zanetti1, Fabiano Comin1, Juliano L Fernandes2, José A Ramires2, Carlos V Serrano Jr21Federal University of Santa Catarina, Florianópolis, Brazil; 2Heart Institute (InCor), University of São Paulo Medical School, São Paulo, BrazilObjectives: Inflammation is known to be a major determinant of the progression of coronary artery disease (CAD). In the present study we have evaluated the plasma levels of cytokines – tumor necrosis factor-α (TNF), interleukin-1α (IL-1), interleukin-6 (IL-6), interferon-γ (IFN), and interleukin-10 (IL-10) – to examine the association between these cytokines and C-reactive protein (CRP) in patients with CAD.Methods: Patients with acute coronary syndromes (ACS; n = 20) were compared with patients with stable angina (SA; n = 20) and with control volunteers (C; n = 20). Blood samples were collected at the time of admission from all patients and 15 and 30 days thereafter.Results: CRP levels (20.8 ± 8.8 mg/L) (mean ± SEM) were higher at baseline in ACS than SA patients (4.1 ± 0.8 mg/L) or the control subjects (5.1 ± 1.8 mg/L) (p < 0.05). At admission, IL-6 was detected in 50% of the ACS patients and 5% of the SA patients or control subjects, while TNF was detected in 35% of the ACS and SA patients but only in 5% of control subjects. Subsequently, IL-6 levels declined and were no longer detectable, while TNF levels increased among ACS patients at all time periods tested when compared with other patients. The presence of IL-1 and IL-10 were not detectable in the blood samples examined, and IFN could only be detected in the ACS group. A significant correlation was observed between IL-6 and CRP levels (r = 0.4; p < 0.01) in all groups. There were no correlations among any of the other cytokines and CRP levels.Conclusions: Our study demonstrates raised levels of TNF, IL6, IFN, and CRP in patients with ACS and a positive correlation between IL6 and CRP but not with the other cytokines. Keywords: cytokines, tumor necrosis factor-α, interleukin-6, C-reactive protein, coronary artery diseas

Relações entre envelhecimento saudável proteção e esquitossomose crônica em humanos

Exportado OPUSMade available in DSpace on 2019-08-14T16:41:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 fabiano_comin_resumo.pdf: 24613 bytes, checksum: b173db28db33409883572115fbd6e570 (MD5) Previous issue date: 4Introdução: Envelhecimento humano está associado com alterações drástica no sistema imune, a maioria relacionada às células T, que resultam no declíneo progressivo de suas funções. Desde que envelhecimento está associado a deficiências na atividade das células T, não é surpresa o fato de indivíduos idosos estarem mais susceptíveis a infecções. Não existem estudos sistemáticos sobre a resposta imune de indivíduos idosos residentes em áreas endêmicas para S. mansoni. Em um estudo prévio em duas áreas endêmicas de Minas Gerais, Brasil, nosso grupo observou um número considerável de indivíduos com idade acima de 60 anos vivendo nessas áreas, que não pode mais ser ignorado. No entanto, nem todos esses idosos tem alta intensidade de infecção e vários deles que sempre viveram nessas áreas endêmicas permanecem protegidos da infecção e apresentam exame de fezes negativo para ovos de S. mansnoni. Uma questão importante para estudos sobre envelhecimento e controle de doenças em países em desenvolvimento é quais diferenças existem no perfil imunológico dos indivíduos que não se infectam, capazes de conferir proteção contra a infecção ou re-infecção. Indivíduos idosos não infectados devem desenvolver mecanismos para compensar a disfunção imune e gerar resposta protetora contra constante ameaça de infecção nessas áreas. Indivíduos e Métodos: No presente estudo foram incluídos 73 indivíduos (38 não infectados e 35 infectados com S. mansoni), divididos em três grupos etários (7-18, 19-59 e 60-94 anos). Avaliamos por ELISA os níveis das citocinas IL-6 e TNF- e do hormônio do envelhecimento DHEA; e por citometria de fluxo a expressão de receptores envolvidos na imunidade inata TLR-1, 2, 3 e 4 em células NK, células dendríticas, monócitos e linfócitos B. Mecanismos reguladores em células T foram avaliados pela expressão de Foxp3 em linfócitos TCD4+CD25+ em cultura (microgranuloma in vitro) e a expressão de LAP em linfócitos CD4+ no sangue periférico. Resultados: Nós mostramos que indivíduos idosos não infectados residentes em área endêmica para S. mansoni apresentam maior freqüência de NKCD56low expressando TLR-1, 2, 3 e 4; maior freqüência de células dendríticas expressando TLR-1 e maior freqüência de monócitos que expressam TLR-1 e 4. Além disso, também podemos observar que indivíduos idosos infectados possuem maior freqüência de células CD4+CD25+Foxp3+ e CD4+LAP+. As dosagens de citocinas não foram diferentes entre os grupos e a dosagem de DHEA foi menor nos indivíduos idosos infectados quando comparados com adultos infectados, indicando que variações nos níveis desse hormônio em nossos indivíduos pode estar mais associado ao sinergismo dos efeitos do envelhecimento e da infecção crônica por S. mansoni. Conclusões: Nós mostramos no presente estudo que dois mecanismos imunológicos contribuem para distinguir indivíduos idosos infectados de idosos saudáveis (não infectados). Primeiro, indivíduos idosos saudáveis desenvolvem mecanismos de imunidade inata que operam na deficiência das células T durante o envelhecimento, conferindo proteção. Segundo, células T reguladoras cronicamente ativadas, capazes de prejudicar a imunidade protetora, estão presentes com maior freqüência em indivíduos idosos infectados. A partir desses resultados, podemos sugerir que a expressão de TLR em células da imunidade inata pode ser relacionada com a condição de negativo para infecção por S. mansoni em alguns indivíduos idosos expostos constantemente à infecção. O desenvolvimento de mecanismos de proteção contra infecção pode representar um biomarcador de envelhecimento saudável nesta população.Introduction: Several aging-related immunological alterations are already described in medical literature, mostly in the T cell compartment. Senescence is reportedly associated with susceptibility to infection and progressive decline in immune function. We have shown previously, in two endemic areas in Minas Gerais, Brazil, that the frequency of individuals over 60 with chronic schistosomiasis is no longer negligible. There has been no systematic study of the immune response of individuals over 60 living in S. mansoni endemic areas. Since aging is associated with a decline in T cell function, it is not surprising that individuals over 60 would be more susceptible to infection. However, not all aged individuals in endemic areas have high intensity of infection, several old individuals who always lived in these endemic areas stay protected from infection. Non-infected, negative individuals may develop compensatory mechanisms to cope with immune dysfunction and to generate protective responses against the constant threat of infection in these areas. An important question for studies of aging and disease control in developing countries is which differences in the immunological profile of these negatively tested (non-infected) individuals can account for their resistance to either infection or re-infection. Subjects and Methods: We studied from 73 individuals (38 health controls and 35 with chronic schistosomiasis) divided into tree age groups (7-18, 19-59 and 60-94 years), were analyzed. Levels of citokines (IL-6 and TNF-) and dehifroepiandrosterone (DHEA) in the plasma were measured. Were analyzed PBMC from two of these 3 groups of individuals (adult and elderly) by flow cytometry for the expression of TLR-1, 2, 3 e 4 in NK cells, NKCD56low, NKCD56high cells, dendritic cells, monocytes and lymphocytes B. Moreover, we have accessed the frequency of regulatory T cells by the expression of latency-associated peptide (LAP) (PE-labeled anti-LAP) in CD4+ T cells (FITC-labeled anti-CD4) and expression of CD25 and FoxP3 in CD4+ T cells. Results: There was no difference in the levels of cytokines among groups. Levels of DHEA were decreased in infected elderly group when compared with infected adult group and infected young group. This can be effects of the synergism among immunesenescence and schistosome chronic infection. We showed, in the present study, that healthy aged individuals (non-infected) develop innate immune mechanisms of protection that replace the age associated decline in T cell function. Non-infected aged individuals from endemic areas of schistosome infection present increase in the frequency of NKCD56low subset of NK cells expressing TLR 1, 2, 3 and 4 as determined by flow cytometry analysis. In addition, the proportion of dendritic cells expressing TLR1 is elevated as well as the frequency of monocytes expressing TLR1 and 4. Moreover, we have observed that infected elderly individuals showed an increase in the frequency CD4+CD25+Foxp3+ and CD4+LAP+ T cells. Conclusions: We showed that two mechanisms contribute to distinguish between infected and non-infected aged individuals. First, healthy aged individuals (non-infected) develop innate immune responses to replace the decline in T cell function that is observed with aging. Second, chronically activated regulatory T cells, that may impair protective immune responses, are more vigorous in infected aged individuals. These results suggest that TLR expression by cells of the innate immune system may be related to the negative status of infection in some aged individuals that are constantly exposed to S. mansoni. Developing mechanisms of protection from infection may represent a biomarker for healthy aging in this population

Detecção e quantificação de anticorpos anti-rábicos neutralizantes pela técnica de citometria de fluxo

The determination of the rabies neutralizing antibody (VNA) response after immunization against rabies is an acceptable index of the efficacy of a vaccine and a successful treatment. Several tests have been developed in attempt to improve the assessment of VNA, from mice inoculation to cell-culture fluorescence inhibition tests. All of them, however, present special difficulties in terms of reading or accuracy. The present study describes a neutralization test performed in cell-culture appraised by flow cytometry (FC). Serial dilutions of the serum samples were mixed in vitro with rabies virus before the addition of BHK-21 cells. After 24h-incubation, cells were released by trypsin treatment, fixed and permeabilized with a p-formaldehyde solution and stained with a rabies virus nucleocapsid protein-specific antibody conjugate. The percentage of virus infection inhibition caused by specific antibodies present in the serum were evaluated in a Beckton & Dickinson FACSCalibur® flow cytometer. A correlation curve between the IU/ml content and the percentage of infective inhibition was built with a reference serum and the VNA titers of serum samples were obtained by extrapolation. Titers obtained by FC and standard test showed an effective pairing results (p < 0.01), with a correlation coefficient (r) = 0.7. These results permit to envisage the FC as a suitable technique to evaluate VNA in sera from immunized animals and likely in human serum samples. Nevertheless, new studies comparing FC to gold-standard techniques are required for determining the FC values of Sensibility and Specificity .A titulação de anticorpos neutralizantes contra o vírus rábico (AcN) pós-imunização é um parâmetro aceito como indicador de eficácia da vacina e do sucesso do processo de imunização. Este estudo descreve um teste de neutralização realizado em cultura de células, analisado através da técnica de citometria de fluxo. Diluições seriadas de amostras de soro foram misturadas in vitro com vírus rábico e adicionados a células BHK-21. Após incubação de 24 h, as células foram individualizadas por tratamento com tripsina, fixadas e permeabilizadas com p-formaldeído e coradas com conjugado específico. A porcentagem de inibição da infecção viral causada pelos anticorpos específicos presentes nas amostras de soro foi determinada em citômetro de fluxo Beckton & Dickinson FACSCalibur® e comparada com um soro de referência internacional. Os títulos de AcN foram determinados por extrapolação. Os níveis de correlação (r) entre os títulos obtidos com CF e SFIMT foi de 0.7712 (p < 0,001), e entre CF e ELISA de 0,6702 (p < 0,001). Os resultados indicam que a CF pode ser utilizada na análise de títulos de anticorpos neutralizantes em amostras de soro, com a vantagem de ser um método automatizado. No entanto, devem ser realizados novos estudos, comparando a CF com as técnicas consideradas como padrão ouro, para que os valores reais de Sensibilidade e Especificidade sejam determinados

Antibody response in cattle after vaccination with inactivated and attenuated rabies vaccines

Despite the absence of current official reports showing the number of cattle infected by rabies, it is estimated that nearly 30,000 bovines are lost each year in Brazil. In order to minimize the important economic losses, control of the disease is achieved by eliminating bat colonies and by herd vaccination. In this study, we compare the antibody response in cattle elicited by vaccination with an attenuated ERA vaccine (AEvac) and an inactivated-adjuvanted PV (IPVvac) vaccine. The antibody titers were appraised by cell-culture neutralization test and ELISA, and the percentage of seropositivity was ascertained for a period of 180 days. IPVvac elicited complete seropositivity rates from day 30 to day 150, and even on day 180, 87% of the sera showed virus-neutralizing antibody titers (VNA) higher than 0.5IU/ml. There were no significant differences between the VNA titers and seropositivity rates obtained with IPVvac in the two methods tested. AEvac, however, elicited significantly lower titers than those observed in the group receiving inactivated vaccine. In addition, the profiles of antirabies IgG antibodies, evaluated by ELISA, and VNA, appraised by cell-culture neutralization test, were slightly different, when both vaccines were compared.A raiva bovina, transmitida principalmente pelo morcego hematófago Desmodus rotundus, é endêmica em várias regiões do Brasil, com um crescente número de casos sendo registrados anualmente. O controle desta infecção em bovinos é feito pelo controle de colônias de morcegos hematófagos e pela vacinação dos rebanhos. Embora as vacinas inativadas sejam mais seguras e mais estáveis que as vacinas atenuadas, estas últimas são ainda amplamente utilizadas em muitas regiões do país, por se acreditar que confiram imunidade mais duradoura. Neste estudo, foram comparadas as respostas anticórpicas de dois grupos de bovinos imunizados com uma vacina atenuada e uma inativada disponíveis comercialmente. Os anticorpos anti-rábicos neutralizantes (AcN) foram titulados pela técnica de soroneutralização em cultura de células BHK-21, enquanto que os níveis de anticorpos anti-rábicos totais (IgG) foram avaliados pela técnica de ELISA, por um período de 180 dias. A vacina inativada induziu a soroconversão (AcN 3 0,5 UI/ml) em 100% dos animais no dia 30, mantendo-se assim até o 150o dia; no dia 180, 87% dos animais ainda mostravam-se com títulos de AcN 3 0,5 UI/ml. Neste grupo, os níveis de IgG anti-rábicas foram semelhantes aos de AcN. A vacina atenuada, no entanto, induziu títulos de AcN e de IgG significantemente menores que os encontrados com a vacina inativada, com consequente diminuição da taxa de soropositividade. Além disso, ao contrário do verificado com a vacina inativada, o perfil de AcN não teve paralelismo com o de anticorpos IgG quando soros foram testados pela técnica de soroneutralização e pelo ELISA, respectivamente

Calculating rabies virus neutralizing antibodies titres by flow cytometry

The determination of the rabies neutralizing antibody (VNA) response after immunization against rabies is an acceptable index of the efficacy of a vaccine and a successful treatment. Several tests have been developed in attempt to improve the assessment of VNA, from mice inoculation to cell-culture fluorescence inhibition tests. All of them, however, present special difficulties in terms of reading or accuracy. The present study describes a neutralization test performed in cell-culture appraised by flow cytometry (FC). Serial dilutions of the serum samples were mixed in vitro with rabies virus before the addition of BHK-21 cells. After 24h-incubation, cells were released by trypsin treatment, fixed and permeabilized with a p-formaldehyde solution and stained with a rabies virus nucleocapsid protein-specific antibody conjugate. The percentage of virus infection inhibition caused by specific antibodies present in the serum were evaluated in a Beckton &amp; Dickinson FACSCalibur® flow cytometer. A correlation curve between the IU/ml content and the percentage of infective inhibition was built with a reference serum and the VNA titers of serum samples were obtained by extrapolation. Titers obtained by FC and standard test showed an effective pairing results (p < 0.01), with a correlation coefficient (r) = 0.7. These results permit to envisage the FC as a suitable technique to evaluate VNA in sera from immunized animals and likely in human serum samples. Nevertheless, new studies comparing FC to gold-standard techniques are required for determining the FC values of Sensibility and Specificity