Functional genomics and proteomics of virus-induced innate immunity pathways

Das angeborene Immunsystem stellt die erste Verteidigungslinie gegen eindringende Pathogene dar. Zellen des angeborenen Immunsystems wie z. B. Makrophagen exprimieren Mustererkennungsrezeptoren (pattern recognition receptors), die konservierte Strukturen vieler Mikroorganismen, sogenannte Pathogen-assoziierte molekulare Muster (pathogen-associated molecular patterns), erkennen. Viren werden vorwiegend durch die Anwesenheit ihrer Genome detektiert und lösen eine Signaltransduktionskaskade aus, die zur Sekretion von Typ I Interferonen (IFNα und IFNβ) führt. Typ I Interferone sind essentiell für die Ausbildung antiviraler Immunität, da sie die Replikation des Virus hemmen und die spezifische Immunabwehr stimulieren. Allerdings sind die Signal-transduktionswege, die zur Interferoninduktion führen, nicht vollständig geklärt, und während die ersten cytosolischen Nukleinsäuresensoren entdeckt werden, häufen sich die Indizien für die Existenz weiterer, noch unbekannter Rezeptoren. Das Ziel dieser Diplomarbeit war, neue Nukleinsäurerezeptoren, die maßgeblich zur angeborenen antiviralen Immunantwort beitragen, zu identifizieren. Im Mittelpunkt des Projekts stand die Hypothese, dass Nukleinsäurerezeptoren an Nukleinsäuren binden und von Nukleinsäuren transkriptionell reguliert werden. Folglich wurde eine Kombination aus Proteomik und Genomik als experimenteller Ansatz gewählt. Zwei Datensätze wurden generiert: Der Proteomikdatensatz enthält Proteine, die an Nukleinsäuren binden. Zu diesem Zweck wurden Pulldown- Experimente mit immobilisierten Nukleinsäuren durchgeführt um Nukleinsäure- bindende Proteine zu isolieren, die anschließend mittels Massenspektrometrie identifiziert wurden. Gene, deren Expression durch Nukleinsäure-stimulation transkriptionell reguliert werden, wurden mithilfe von Microarrays erfasst und repräsentieren den Genomikdatensatz. Basierend auf der eingangs erwähnten Hypothese, wurden die Proteine, die in beiden Datensätzen vorhanden waren, in eine Kandidatenliste aufgenommen. Zu den 24 Kandidaten zählen fünf Proteine, deren Funktion innerhalb der Nukleinsäuresignaltransduktion bereits bekannt ist, wie z. B. die Rezeptoren für doppel-strängige RNA (dsRNA) RIG-I und MDA-5. Die Tatsache, dass diese fünf Proteine Teil der Kandidatenliste sind, validiert den experimentellen Ansatz. Nachdem die Kandidatenliste erstellt worden war, wurden die Microarray- Ergebnisse mittels real-time PCR bestätigt. Weiters wurden die Kandidaten auf ihre funktionelle Relevanz für die Entstehung einer Nukleinsäure-stimulierten antiviralen Immunantwort untersucht. Zu diesem Zweck wurde die Auswirkung des Silencings der einzelnen Kandidaten durch RNA- Interferenz auf IFNβ− Induktion aufgrund Stimulation mit Nukleinsäuren mittels real-time PCR bestimmt. Die fünf Kontrollkandidaten zeigten die erwarteten Effekte, und zwölf der restlichen 19 Kandidaten hatten einen positiven Einfluss auf die IFNβ Induktion, wenn mit dem synthetischen dsRNA- Analogon polyI:C stimuliert wurde. Im Rahmen dieser Diplomarbeit wurde somit die Basis für weiterführende Untersuchungen zur Identifikation von Nukleinsäurerezeptoren geschaffen. Parallel zu der auf RNA- Interferenz basierenden Evaluation der Kandidaten wurde das DNA- modifizierende Enzym Kandidat 4 genauer untersucht. Kandidat 4 ist ein IFNβ- induzierbares, perinukleäres Protein. Mutationen, die eine Inaktivierung von Kandidat 4 nach sich ziehen, bewirken eine schwere Erkrankung mit entzündlicher Komponente. Welche Rolle Kandidat 4 bei DNA- stimulierter IFNβ- Induktion spielt, konnte aufgrund widersprüchlicher Ergebnisse nicht geklärt werden. Weitere Versuche sind notwendig um die Funktion von Kandidat 4 zu verstehen.The innate immune system is the first line of defense against invading pathogens. Innate immune cells such as macrophages express pattern recognition receptors (PRRs) that detect conserved structures shared by many microbes, so-called pathogen-associated molecular patterns (PAMPs). Viruses are typically sensed by the presence of their genomes. Various PRRs are implicated in virus detection and trigger a signaling cascade that leads to the secretion of type I interferon (IFNα und IFNβ). Type I interferons are essential for antiviral immunity, as they limit virus replication and stimulate the adaptive immune system. However, the knowledge on the signaling pathways leading to interferon induction is still incomplete, and while the first cytosolic nucleic acid sensors are being identified, evidence for the existence of more, yet unknown receptors accumulates. Therefore, the aim of my diploma thesis was to identify novel nucleic acid sensors implicated in antiviral innate immunity. The central hypothesis was that nucleic acid receptors bind to nucleic acids and are transcriptionally regulated by nucleic acid stimulation. To this end we chose a combined proteomics and genomics approach. Two datasets were generated: The proteomics dataset consists of nucleic acid binding proteins that were identified by pull-down experiments with immobilized nucleic acids and subsequent mass spectrometry analysis. The genomics dataset includes genes that are regulated by nucleic acids as determined by microarray analysis. Based on the before mentioned hypothesis, proteins that belonged to both datasets were selected to compile a list of 24 candidate proteins. Among these 24 candidates are five proteins with an established role in nucleic acid signaling e. g. the receptors for double-stranded RNA (dsRNA), RIG-I and MDA-5, whose presence in the candidate list validates the approach. Once the candidate list had been generated, the microarray data was confirmed for selected candidate by real-time PCR. In order to assess the functional relevance of each candidate for antiviral innate immunity, the effect of candidate silencing on nucleic acid-stimulated IFNβ induction was measured by real-time PCR. The five control candidates showed the expected effects and 12 out of the 19 remaining candidates positively regulate IFNβ induction by polyI:C, the synthetic analogue of dsRNA. Thus this thesis provided the basis for further research leading to the identification of additional nucleic acid receptors. In parallel to the RNAi-based evaluation of candidates, the DNA-modifying enzyme candidate 4, was investigated in more detail. Candidate 4 is a IFNβ-inducible, perinuclear protein. When inactivated by mutation, candidate 4 has been reported to cause a severe disease with an inflammatory component. Contradictory results were generated regarding its role in DNA-mediated IFNβ induction. Therfore, further studies are needed to elucidate its mechanism of action

Nucleic acid sensing in the cytosol

Es ist seit langem bekannt, dass Peroxisomen eine zentrale Rolle bei der Regulation verschiedener metabolischer Prozesse in Säugerzellen einnehmen. Diese Organellen steuern in enger Kooperation mit Mitochondrien die Synthese und den Abbau von Lipiden und reaktiven Sauerstoffspezies. Während Mitochondrien als Ort von antiviraler Signaltransduktion bereits etabliert sind, ist eine Rolle für Peroxisomen in der Immunantwort unbekannt. Das angeborene Immunsystem detektiert Virusinfektionen zumeist über die Anwesenheit der Nukleinsäuren des Erregers mit Hilfe sogenannter pattern recognition-Rezeptoren. Die Familie der RIG-I-ähnlichen Rezeptoren erkennt virale RNA im Zytosol infizierter Zellen und löst unter Verwendung des Adaptorproteins MAVS eine Signaltransduktionskaskade aus, die letztlich zur Induktion von Typ I Interferon und Interferon-stimulierten Genen führt. Die Gesamtheit dieser Abwehrfaktoren ermöglicht einen antiviralen Zustand der befallenen und benachbarten Zellen. Ich zeige in dieser Studie, dass MAVS - zusätzlich zur bekannten Lokalisation auf Mitochondrien - auch auf Peroxisomen zu finden ist. Mehrere unabhängige Befunde belegen die Anwesenheit von MAVS auf Peroxisomen: Erstens, MAVS ist mit peroxisomalen Markerproteinen in humanen und murinen Zellen kolokalisiert. Zweitens, nach Zellfraktionierung sedimentiert MAVS in der gleichen Fraktion wie andere peroxisomale Proteine. Um die funktionelle Signifikanz der Lokalisationsdaten zu beurteilen, wurden Zelllinien generiert, die sich einzig durch die Lokalisation von MAVS auf Peroxisomen und/oder Mitochondrien unterscheiden. Ich zeige hier, dass peroximales und mitochondriales MAVS nacheinander agieren, um einen antiviralen Zustand herbeizuführen. Nach viraler Infektion induziert peroxisomales MAVS eine schnelle Interferon-unabhängige Expression von Abwehrfaktoren, wodurch ein vorübergehender Schutz gewährleistet wird. Mitochondriales MAVS hingegen aktiviert Interferon-abhängige Signaltransduktionswege mit langsamerer Kinetik, die die antivirale Antwort verstärken und stabilisieren. Diese Forschungsergebnisse belegen, dass Peroxisomen nicht nur metabolischen Zwecken dienen, sondern auch einen wichtigen Ort der antiviralen Signaltransduktion darstellen.Peroxisomes have long been established to play a central role in regulating various metabolic activities in mammalian cells. These organelles act in concert with mitochondria to control the synthesis and degradation of lipids and reactive oxygen species. However, while mitochondria have emerged as an important site of antiviral signal transduction, a role for peroxisomes in immune defense is unknown. The innate immune system typically detects viral infections by the presence of pathogen-derived nucleic acids. The RIG-I-like receptors, one family of so-called pathogen recognition receptors, sense viral RNA in the cytosol of infected cells and initiate a signal transduction cascade that depends on the adapter protein MAVS and ultimately leads to induction of type I interferon and interferon-stimulated genes. Collectively these defense factors establish an antiviral state in infected and adjacent cells. In this study I show that MAVS - in addition to its known localization on mitochondria - is also expressed on peroxisomes. Several lines of evidence indicate the presence of MAVS on peroxisomes. First, MAVS co-localizes with peroxisomal marker proteins in human and murine cells. Second, MAVS co-purifies with peroxisomal proteins in cell fractionation experiments. To determine the functional significance of these findings, I generated cell lines that differ only in their subcellular localization of MAVS to peroxisomes and/or mitochondria. I find that peroxisomal and mitochondrial MAVS act sequentially to create an antiviral cellular state. Upon viral infection, peroxisomal MAVS induces the rapid interferon-independent expression of defense factors that provides short-term protection, whereas mitochondrial MAVS activates an interferon-dependent signaling pathway with delayed kinetics, which amplifies and stabilizes the antiviral response. These results establish that peroxisomes are not solely metabolic organelles, but are an important site of antiviral signal transduction.submitted by Evelyn DixitZsfassung in dt. SpracheWien, Med. Univ., Diss., 2011OeBB(VLID)171624

Functional Dissection of the TBK1 Molecular Network

TANK-binding kinase 1 (TBK1) and inducible IkB-kinase (IKK-i) are central regulators of type-I interferon induction. They are associated with three adaptor proteins called TANK, Sintbad (or TBKBP1) and NAP1 (or TBKBP2, AZI2) whose functional relationship to TBK1 and IKK-i is poorly understood. We performed a systematic affinity purification–mass spectrometry approach to derive a comprehensive TBK1/IKK-i molecular network. The most salient feature of the network is the mutual exclusive interaction of the adaptors with the kinases, suggesting distinct alternative complexes. Immunofluorescence data indicated that the individual adaptors reside in different subcellular locations. TANK, Sintbad and NAP1 competed for binding of TBK1. The binding site for all three adaptors was mapped to the C-terminal coiled-coil 2 region of TBK1. Point mutants that affect binding of individual adaptors were used to reconstitute TBK1/IKK-i-deficient cells and dissect the functional relevance of the individual kinase-adaptor edges within the network. Using a microarray-derived gene expression signature of TBK1 in response virus infection or poly(I:C) stimulation, we found that TBK1 activation was strictly dependen

Diverse intracellular pathogens activate Type III Interferon expression from peroxisomes

Type I Interferon (IFN) responses are considered the primary means by which viral infections are controlled in mammals. Despite this view, several pathogens activate antiviral responses in the absence of Type I IFNs. The mechanisms controlling Type I IFN-independent responses are undefined. We have found that RIG-I like Receptors (RLRs) induce Type III IFN expression in a variety of human cell types, and identified factors that differentially regulate Type I and III IFN expression. We identified peroxisomes as a primary site that initiates Type III IFN expression, and revealed that the process of intestinal epithelial cell differentiation upregulates peroxisome biogenesis and promotes robust Type III IFN responses in human cells. These findings highlight the interconnections between innate immunity and cell biology