Conditionally Stabilized dCas9 Activator for Controlling Gene Expression in Human Cell Reprogramming and Differentiation

CRISPR/Cas9 protein fused to transactivation domains can be used to control gene expression in human cells. In this study, we demonstrate that a dCas9 fusion with repeats of VP16 activator domains can efficiently activate human genes involved in pluripotency in various cell types. This activator in combination with guide RNAs targeted to the OCT4 promoter can be used to completely replace transgenic OCT4 in human cell reprogramming. Furthermore, we generated a chemically controllable dCas9 activator version by fusion with the dihydrofolate reductase (DHFR) destabilization domain. Finally, we show that the destabilized dCas9 activator can be used to control human pluripotent stem cell differentiation into endodermal lineages.Peer reviewe

Generation of a SOX2 reporter human induced pluripotent stem cell line using CRISPR/SaCas9

SOX2 is an important transcription factor involved in pluripotency maintenance, pluripotent reprogramming and differentiation towards neural lineages. Here we engineered the previously described HEL24.3 hiPSC to generate a SOX2 reporter by knocking-in a T2A fused nuclear tdTomato reporter cassette before the STOP codon of the SOX2 gene coding sequence. CRISPR/SaCas9-mediated stimulation of homologous recombination was utilized to facilitate faithful targeted insertion. This line accurately reports the expression of endogenous SOX2 and therefore constitutes a useful tool to study the SOX2 expression dynamics upon hiPSC culture, differentiation and somatic cell reprogramming. (C) 2017 The Authors. Published by Elsevier B.V.Non peer reviewe

An Activating STAT3 Mutation Causes Neonatal Diabetes through Premature Induction of Pancreatic Differentiation

Activating germline mutations in STAT3 were recently identified as a cause of neonatal diabetes mellitus associated with beta-cell autoimmunity. We have investigated the effect of an activating mutation, STAT3(K392R,) on pancreatic development using induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from a patient with neonatal diabetes and pancreatic hypoplasia. Early pancreatic endoderm differentiated similarly from STAT3(K392R) and healthy-control cells, but in later stages, NEUROG3 expressionwas upregulated prematurely in STAT3(K392R) cells together with insulin (INS) and glucagon (GCG). RNA sequencing (RNA-seq) showed robust NEUROG3 downstream targets upregulation. STAT3 mutation correction with CRISPR/Cas9 reversed completely the disease phenotype. STAT3(K392R) -activating properties were not explained fully by altered DNA-binding affinity or increased phosphorylation. Instead, reporter assays demonstrated NEUROG3 promoter activation by STAT3 in pancreatic cells. Furthermore, proteomic and immunocytochemical analyses revealed increased nuclear translocation of STAT3(K392R). Collectively, our results demonstrate that the STAT3(K392R) mutation causes premature endocrine differentiation through direct induction of NEUROG3 expression.Peer reviewe

VSNL1:n poiston vaikutus hiirien suonten muodostukseen

Visinin-like 1 eli VSNL 1-geeni sijaitsee kromosomissa 2p24 ja se kuuluu NCS-perheeseen (Neuronal Calcium sensor) eli hermosolujen kalsiumsensoreihin. VSNL 1-geeniä ilmennetään runsaasti aivojen hermosoluissa sekä keskus- että ääreishermostossa. Sitä ilmennetään myös muissa elimissä; muun muassa maksassa, munuaisissa, sydämessä ja ihossa etenkin yksilön kehityksen aikana. VSNL1 vaikuttaa sydämen kehitykseen ja sitä on kehittyvän sydämen kudoksissa ja kehittyvissä laskimorakenteissa. Laskimoiden endoteelisolut, joista myöhemmin kehittyy myös imusuonisto, ilmentävät VSNL1-geeniä. VSNL1-poistogeenisillä hiirillä on häiriöitä imusuoniston kehityksessä. Niillä esiintyy ihonalaista turvotusta sekä verenvuotoa ja niiden imusuonet ovat hyperplastisia ja täyttyneet verellä. Sikiöt kuolevat noin 15 vuorokauden ikäisinä. Tämän fenotyypin taustalla olevista solun sisäisistä ja molekylaarisista mekanismeista tarvitaan lisää tietoa, jotta geenin toimintaa ja vaikutusta ymmärrettäisiin nykyistä tarkemmin. Molekylaarisia mekanismeja lähdettiin tässä työssä selvittämään kvantitatiivisen reaaliaikaisen polymeraasiketjureaktion (RT qPCR) avulla. RT qPCR:n avulla pyrittiin määrittämään suonten muodostukseen vaikuttavien proteiinien mRNA tasojen mahdollisia muutoksia VSNL1-poistogeenisten hiirten E11,5 ja E12,5 päiväisillä sikiöillä. Tutkittuja geenejä oli kymmenen: VEGF-C, VEGF-D, VEGFR-2, VEGFR-3, sVEGFR-2, NRP-2, ANG-1, ANG-2, TIE-1 ja TIE-2. Ilmentymistasot pysyivät hyvin samanlaisina lähes kaikilla tutkituilla geeneillä, ja osa tuloksista oli ristiriitaisia eri näytteiden välillä. VEGFR-2 ja sVEGFR-2 geenien ilmentymistasot olivat hieman koholla, mikä osaltaan saattaisi selittää VSNL1 poistogeenisten hiirten fenotyypin, sillä VEGFR-2 indusoi endoteelisolujen proliferaatiota. Kasvutekijä VEGF-D:n mRNA:n ilmentymistasot olivat selkeästi koholla E12,5 sikiöillä. VEGF-D:n tiedetään indusoivan imusuonten muodostusta ja sen on todettu aiheuttavan imusuonten laajentumista sekä kudosten turpoamista, joten sen kohonnut ilmentyminen VSNL1-poistogeenisillä hiirillä voisi olla varteenotettava selitys muutoksiin VSNL1-poistogeenisissä sikiöissä.Visinin-like1, also known as VSNL1 is localized in chromosome region 2p24 and is a member of the neuronal calcium sensor (NCS) family. VSNL1 is abundantly expressed in the neuronal cells in the central and in the peripheral nervous system. It is also expressed in many other organs such as liver, kidney, heart and skin especially during the embryogenesis. VSNL1 is found to be involved in heart development and it is expressed in the developing heart tissues and in the developing venous system. The endothelial cells of veins where from lymphatic vessels start to develop also express VSNL1. VSNL1 knockout mice have disorders in lymphangiogenesis. They display subcutaneous edema and hemorrhage and their lymphatic vessels are hyper plastic and filled with blood. Embryos die around the age of 15 embryonic days. Further studies are needed to reveal the cellular and molecular mechanisms responsible for phenotype to increase understanding of function and influence of VSNL1. To investigate the molecular mechanisms the real time quantitative polymerase chain reaction (RT qPCR) was performed in this study. With RT qPCR was aimed to identify possible altered mRNA levels of proteins which have influence on angiogenesis using VSNL1 knockout mouse E11,5 and E12,5 embryos as samples. The study included ten genes: VEGF-C, VEGF-D, VEGFR-2, VEGFR-3, sVEGFR-2, NRP-2, ANG-1, ANG-2, TIE-1 and TIE-2. The expression levels of mRNA were observed to stay approximately the same between wild type mouse embryos and knockout mouse embryos of almost all genes investigated and part of the results were contradictory within samples. The expression levels of VEGFR-2 and sVEGFR-2 were slightly raised which could be the explanation to the altered phenotype, because VEGFR-2 is described to induce the proliferation of endothelial cells. The expression levels of growth factor VEGF-D mRNA were distinctly raised in E12,5 embryos. VEGF-D is established to induce the formation of lymphatic vessels and it has been discovered to cause dilating of lymphatic vessels and edema so its over expression in VSNL1 knockout mice could be a possible explanation to changes in VSNL1 knockout embryos

Generation of an OCT4 reporter human induced pluripotent stem cell line using CRISPR/SpCas9

OCT4 is a crucial transcription factor in the pluripotent stem cell gene regulatory network and an essential factor for pluripotent reprogramming. We engineered the previously reported HEL24.3 hiPSC to generate an OCT4 reporter cell line by knocking-in a T2A nuclear EmGFP reporter cassette before the OCT4 gene STOP codon sequence. To enhance targeted insertion, homologous recombination was stimulated using targeted cutting at the OCT4 STOP codon with CRISPR/SpCas9. This HEL24.3-OCT4-nEmGFP cell line faithfully reports endogenous OCT4 expression, serving as a useful tool to examine temporal changes in OCT4 expression in live cells during hiPSC culture, differentiation and somatic cell reprogramming. (C) 2017 The Authors. Published by Elsevier B.V.Non peer reviewe

Modeling congenital hyperinsulinism with patient stem cell derived beta cells

Synnynnäisen hyperinsulinismin tautimallinnus kantasoluperäisten beetasolujen avulla TAUSTA: Synnynnäinen hyperinsulinismi on haiman saarekkeiden insuliinia tuottavien beetasolujen perinnöllinen sairaus. Beetasolun tehtävä kehossa on aistia verensokeritasoa ja erittää verensokeria laskevaa insuliinia. Yleisimmin se johtuu beetasolun KATP-kanavan mutaatiosta (KATP-HI) mikä johtaa beetasolun kykenemättömyyteen aistia verensokeritasoa ja jatkuvaan insuliinineritykseen. KATP-HI ilmenee vastasyntyneellä hyvin matalana verensokerina, mikä vaarantaa aivojen kehityksen ja voi uhata henkeä. Suuri osa KATP-HI -potilaista ei reagoi nykykäytössä oleville lääkkeille. Olisi tarve kehittää parempia hoitoja tähän vakavaan sairauteen, mutta se on vaikeaa sillä ainoa lähde tutkimuksessa tarvittavaan beetasolumateriaaliin on aivokuolleet luovuttajat. Tämän tutkimuksen tavoitteena on kehittää uusi tautimalli KATP-HI:n tutkimukseen, mikä mahdollistaisi laajamittaiset lääkekokeet. MENETELMÄT: KATP-HI potilaalta eristettiin ihosoluja jotka ohjelmoitiin monikykyisiksi kantasoluiksi. Nämä kantasolut vastaavat alkionkehityksessä ensimmäisiä hedelmöittyneestä munasolusta jakautuvia soluja ja voivat siten erilaistua miksi tahansa elimistön kudokseksi. Kantasoluja erilaistettiin beetasoluiksi maljalla antamalla niille sikiönaikaista kehitystä jäljitteleviä kasvutekijöitä. Näitä beetasoluja verrattiin samaan tapaan terveistä soluista tuotettuihin beetasoluihin. TULOKSET: Sairaat beetasolut tuottivat enemmän insuliinia matalassa sokerissa eivätkä reagoineet KATP-HIssa käytettäviin lääkkeisiin. Näitä beetasoluja siirrettiin myös immuunipuutteisiin hiiriin. Sairaan siirteen saaneille hiirille kehittyi matalampi verensokeri ja niiden verenkierrossa havaittiin korkeammat pitoisuudet ihmisperäistä insuliinia myös paaston ja niille aiheutetun matalan verensokeriin aikana. YHTEENVETO: Olemme luoneet tautimallin joka jäljittelee KATP-HI sairauden piirteet maljalla sekä elävässä eläimessä, mikä mahdollistaa mm. uusien hoitomuotojen etsimisen KATP-HI -potilaiden auttamiseksi.Modeling congenital hyperinsulinism with patient stem cell derived β cells Congenital hyperinsulinism (CHI), caused by mutations in the KATP -channel encoding genes (KATPHI), is a potentially life-threatening disorder of the beta cells. We aimed to create a model of KATPHI based on patient iPSC derived beta-like cells (BLCs) to allow future studies for improved management of KATPHI. Cells were derived from a patient with a homozygous ABCC8V187D -mutation, leading to loss of KATP -channel membrane expression due to loss of the SUR1 subunit, causing diazoxide unresponsive diffuse CHI. The mutation was corrected with CRISPR/Cas9 to enable controlled studies with isogenic cells. Quantification of the in vitro differentiated endocrine populations showed increased differentiation to beta- and delta cells in the SUR1-mutants. The proliferation of insulin positive cells was also increased in the SUR1-mutants. The SUR1-mutant BLCs secreted more insulin and did not respond to KATP -channel acting drugs in vitro. Mice carrying implants of SUR1-mutant islet-like clusters developed hyperinsulinemic hypoglycemia and their grafts failed to shut down insulin secretion during hypoglycemia. In conclusion, we have created a model of KATPHI in vitro and in humanized mice allowing study of pathophysiology and management of KATPHI