Evaluación de diferentes fórmulas de medio de transporte viral para su uso en la detección de ARN de SARS-CoV-2 mediante PCR a tiempo real en muestras clínicas.

La rápida expansión del síndrome respiratorio agudo causado por el coronavirus respiratorio 2 (SARS-CoV-2) produjo una elevada demanda y escasez de reactivos comerciales asociados a pruebas de reacción en cadena de la polimerasa (siglas en inglés, PCR). Desde el grupo de Genética de Micobacterias de la Universidad de Zaragoza, se propuso al Hospital Universitario Miguel Servet emplear el medio de transporte destinado a la extracción de Ácido Ribonucleico (ARN) de micobacterias, como medio alternativo para la toma de muestras respiratorias procedentes de pacientes con sospecha de infección por SARS-CoV-2. Debido a la complejidad de este medio, se propuso desarrollar diferentes fórmulas simplificadas, capaces de actuar como medio de transporte y medio de inactivación para SARS-CoV-2. Para poder estudiar el comportamiento de estas formulaciones, se solicitó al Comité de Ética de la Investigación de la Comunidad de Aragón (CEICA) la toma de muestra a pacientes positivos de covid-19 en los diferentes medios desarrollados para poder realizar la extracción del ARN del virus y su amplificación mediante PCR cuantitativa a tiempo real (qRT-PCR).Los resultados mostraron que ninguna de las fórmulas desarrolladas inhibía el proceso de amplificación, y, que la variación del número de Ct (en inglés, ciclo umbral) obtenido entre el Medio de Transporte Viral (siglas en inglés, VTM) control y los desarrollados, no fueron elevados. Además, se evaluó la posibilidad de que la acción del medio de transporte sustituyera al proceso de lisis al emplear guanidinio como agente lisante, eliminando la capacidad infectiva de la muestra. Tras comprobar la eficacia biológica y optimizar el proceso, se realizó un estudio económico con el fin de seleccionar una de las fórmulas como alternativa para la toma de muestras respiratorias para el diagnóstico de covid-19.<br /

Estudio epidemiológico de brotes de listeriosis: interés de técnicas moleculares

Listeria monocytogenes es el agente causal de la listeriosis, una enfermedad grave con una alta tasa de mortalidad en personas de riesgo, cuya incidencia a nivel mundial es baja. La principal vía de transmisión es el consumo de alimentos. Concretamente, son los alimentos listos para el consumo (Read To Eat- RTE), por lo que su control en la industria representa una gran preocupación.La caracterización molecular de los aislados de este patógeno, durante el procesado de los alimentos, permite la identificación de nichos y reservorios del mismo en el ambiente de la industria y, su posible transferencia entre el ambiente y el producto. Además, aporta información de interés para el estudio epidemiológico de casos y brotes de listeriosis.El objetivo general de este trabajo es realizar el análisis y discusión de la información epidemiológica asociada a brotes de listeriosis humana producidos por el consumo de alimentos, aportando información sobre las técnicas de caracterización molecular de los aislados, así como los principales subtipos implicados en los brotes.Actualmente, la técnica de referencia para la caracterización molecular de los aislaos de L. monocytogenes, por el CDC (Centers for Disease Control and Prevention) y el Laboratorio de Referencia de la Unión Europea de L. monocytogenes.<br /

Importancia actual del Género Enterococcus spp. en los alimentos y metodologías para su caracterización molecular

El género Enterococcus spp. incluye a un conjunto de bacterias ácido-lácticas (BAL),capaces de adaptarse, y resistir a diversos ambientes. Aunque su mayor reservorio se encuentra en el tracto gastrointestinal de humanos y animales, están presentes en diferentes matrices alimentarias, involucrados en los procesos de fermentación de muchos alimentos, contribuyendo positivamente a sus características organolépticas. La producción de bacteriocinas con acción antimicrobiana asociada a numerosas cepas de Enterococcus se aplica en la conservación de productos alimenticios y actualmente se está valorando su carácter probiótico. Por otro lado, la incidencia del Género Enterococcus en infecciones nosocomiales, y su elevada resistencia intrínseca y adquirida a antibióticos supone un problema terapéutico que afecta a nivel mundial, lo que hace imprescindible la caracterización genética de Enterococcus de origen alimentario y la determinación de su patogenicidad mediante la detección de genes de resistencia y factores de virulencia. A pesar de que existen diversas técnicas para la caracterización molecular de microorganismos, la más utilizada para el género Enterococcus es la PFGE por ser la técnica más discriminatoria y reproducible, que permite determinar las similitudes genéticas entre los aislados aportando una información de gran utilidad para la identificación de reservorios en la cadena alimentaria y su implicación en la salud pública y en la industria de los alimentos. Dada la controversia que existe sobre los Enterococcus, la finalidad de este trabajo es, en definitiva, evaluar el riego-beneficio asociado al género Enterococcus en alimentos.<br /

Evaluación de métodos moleculares para la detección de Salmonella spp. en alimentos

Las toxiinfecciones alimentarias se producen por consumo de alimentos contaminados por agentes de origen biológico y/o sus toxinas. Dentro de éstas, la salmonelosis es la segunda zoonosis más notificada en la UE (EFSA, 2019), siendo la carne de pavo y pollo los alimentos con mayor prevalencia. Para carne picada y preparados de carne a base de carne de aves de corral destinados a ser consumidos cocinados, la normativa en vigor en la UE establece la obligación del operador económico de comprobar que Salmonella no se detecte en 25 g de producto. La disponibilidad de métodos rápidos, sencillos, económicos y fiables, alternativos al método de referencia EN/ISO 6579, permitiría a la industria la toma de decisiones en menor tiempo y la aplicación temprana de medidas correctoras, además de potenciales ventajas económicas. El Trabajo Fin de Grado que se propone se desarrolla en colaboración con una empresa dedicada al desarrollo de kits rápidos PCR, para la detección de agentes patógenos de interés en salud pública.<br /

Contribución al estudio de determinantes genéticos de resistencia a macrólidos y lincosamidas en bacterias gram positivas por PCR a tiempo real

Optimización del método PCR a tiempo real para la detección de determinantes genéticos de resistencia a macrólidos y lincosamidas. Evaluación de la técnica y aplicación de ésta para la caracterización de la resistencia a clindamicina en cepas de listeria spp. aisladas de alimentos

Evaluation of a Novel Commercial Real-Time PCR Assay for the Simultaneous Detection of Cryptosporidium spp., Giardia duodenalis, and Entamoeba histolytica

Thorough independent assessment of the diagnostic performance of novel diagnostic assays is essential to ascertain their true usefulness and applicability in routine clinical practice. This is particularly true for commercially available kits based on multiplex real-time PCR aimed to detect and differentiate multiple pathogens in a single biological sample. Cryptosporidium spp., Giardia duodenalis, and Entamoeba histolytica are the most common diarrhea-causing protozoan species globally. Misdiagnosis is a concern for asymptomatic and chronic infections. Multiplexing, i.e., the detection of more than one parasite in a single test by real-time PCR, allows high diagnostic performance with favorable cost-effectiveness. We conducted a clinical evaluation of the VIASURE Cryptosporidium, Giardia, & E. histolytica real-time PCR assay (CerTest Biotec, San Mateo de Gallego, Spain) against a large panel (n = 358) of well-characterized DNA samples positive for Cryptosporidium spp. (n = 96), G. duodenalis (n = 115), E. histolytica (n = 25), and other parasitic species of the phyla Amoebozoa (n = 11), Apicomplexa (n = 14), Euglenozoa (n = 8), Heterokonta (n = 42), Metamonada (n = 37), Microsporidia (n = 4), and Nematoda (n = 6). DNA samples were obtained from clinical stool specimens or cultured isolates in a national reference center. Estimated sensitivity and specificity were 0.96 and 0.99 for Cryptosporidium spp., 0.94 and 1 for G. duodenalis, and 0.96 and 1 for E. histolytica, respectively. Positive and negative predictive values were calculated as 1 and 0.98 for Cryptosporidium spp., 0.99 and 0.98 for G. duodenalis, and 1 and 0.99 for E. histolytica, respectively. The assay identified six Cryptosporidium species (Cryptosporidium hominis, Cryptosporidium parvum, Cryptosporidium canis, Cryptosporidium felis, Cryptosporidium scrofarum, and Cryptosporidium ryanae) and four G. duodenalis assemblages (A, B, C, and F). The VIASURE assay provides rapid and accurate simultaneous detection and identification of the most commonly occurring species and genetic variants of diarrhea-causing parasitic protozoa in humans. IMPORTANCE Thorough independent assessment of the diagnostic performance of novel diagnostic assays is essential to ascertain their true usefulness and applicability in routine clinical practice. This is particularly true for commercially available kits based on multiplex real-time PCR aimed to detect and differentiate multiple pathogens in a single biological sample. In this study, we conducted a clinical evaluation of the VIASURE Cryptosporidium, Giardia, & E. histolytica real-time PCR assay (CerTest Biotec) for the detection and identification of the diarrhea-causing enteric protozoan parasites Cryptosporidium spp., G. duodenalis, and E. histolytica. A large panel of well-characterized DNA samples from clinical stool specimens or cultured isolates from a reference center was used for this purpose. The VIASURE assay demonstrated good performance for the routine testing of these pathogens in clinical microbiological laboratories

Retrospective Study for the Clinical Evaluation of a Real-Time PCR Assay with Lyophilized and Ready-to-Use Reagents for Streptococcus agalactiae Detection in Prenatal Screening Specimens

Streptococcus agalactiae is a leading cause of sepsis and meningitis in newborns and young infants. Screening programs and intrapartum antibiotic prophylaxis have reduced early neonatal onset of disease. The aim of this study was to evaluate a molecular assay with lyophilized and ready-to-use reagents: VIASURE® Streptococcus B Real Time PCR detection kit (CerTest Biotec) (Viasure qPCR assay) compared to both the GBS culture and a molecular assay with separated and frozen reagents: Strep B Real-TM Quant (Sacace Biotecnologies®) (Sacace qPCR assay). A total of 413 vaginal–rectal swabs from women between the 35th and 37th weeks of pregnancy were processed. GBS culture was firstly achieved through Granada medium and Columbia CNA agar at 35 °C in aerobic conditions. Then, nucleic acid extraction was performed for subsequent molecular analysis using both commercial assays. Discordant results were resolved via bidirectional Sanger sequencing. Viasure qPCR assay clinical sensitivity was 0.97 (0.92–0.99) and specificity 1 (0.98–1). This retrospective study demonstrated the good clinical parameters and the strong overall agreement (99.3%) between the Viasure qPCR assay and both reference assays. Finally, the added value observed of the assay under study was the stabilized and ready-to-use format, reducing the number of time-consuming steps, permitting the storage at room temperature, facilitating transport, being environmentally respectful, and reducing additional costs

Métodos moleculares para la detección de Salmonella en los alimentos

Salmonella spp. es un microrganismo patógeno que puede estar presente en una amplia variedad de alimentos. Es un agente zoonótico responsable de la salmonelosis humana, siendo la segunda zoonosis más frecuente en Europa, lo que supone un importante problema de salud pública. El Reglamento (CE) nº 2073/2005 relativo a los criterios microbiológicos aplicables a los productos alimenticios establece como criterio de seguridad alimentaria “no detectado” en 25 gramos de alimento. En la industria alimentaria, son los operadores los responsables de que los alimentos cumplan este criterio a lo largo de su vida útil.El método de referencia es el descrito en la norma UNE-EN ISO 6579:2017, basado en la microbiología convencional. Sin embargo, dicho método presenta ciertos inconvenientes, ya que se trata de un procedimiento largo y costoso en el que se utilizan varios medios de cultivo. Por ello, la industria alimentaria requiere, cada vez más, métodos alternativos a los métodos ISO, que permitan la detección de Salmonella de forma fiable, rápida y que puedan analizar un elevado número de muestras. Entre ellos se encuentra la técnica molecular Real Time Polymerase Chain Reaction (rt-PCR), que permite la obtención de resultados en un menor tiempo, mejorando el flujo de trabajo para su integración dentro de su sistema de autocontrol APPCC.<br /

Evaluation of the Use of Singleplex and Duplex CerTest VIASURE Real-Time PCR Assays to Detect Common Intestinal Protist Parasites

Cryptosporidium spp., Giardia duodenalis and Entamoeba histolytica are species of protozoa- causing diarrhoea that are common worldwide, while Entamoeba dispar, Dientamoeba fragilis and Blastocystis sp. appear to be commensal parasites whose role in pathogenicity remains controversial. We conducted the clinical evaluation of five singleplex and one duplex CerTest VIASURE Real-Time PCR Assays against a large panel of positive DNA samples (n = 358), and specifically to Cryptosporidium spp. (n = 96), G. duodenalis (n = 115), E. histolytica (n = 25) E. dispar (n = 11), Blastocystis sp. (n = 42), D. fragilis (n = 37), and related parasitic phylum species such as Apicomplexa, Euglenozoa, Microsporidia and Nematoda. DNA samples were obtained from clinical stool specimens or cultured isolates in a national reference centre. Estimated diagnostic sensitivity and specificity values were 0.94-1 for Cryptosporidium spp., 0.96-0.99 for G. duodenalis, 0.96-1 for E. histolytica, 1-1 for E. dispar, and 1-0.99 for D. fragilis in the evaluated singleplex assays. In the duplex assay for the simultaneous detection of Blastocystis sp. and D. fragilis these values were 1-0.98 and 1-0.99, respectively. Measures of diagnostic precision for repeatability and reproducibility were found to be under acceptable ranges. The assays identified six Cryptosporidium species (C. hominis, C. parvum, C. canis, C. felis, C. scrofarum, and C. ryanae), four G. duodenalis assemblages (A, B, C, and F), and six Blastocystis subtypes (ST1-ST5, and ST8). The evaluated singleplex and duplex VIASURE Real-Time PCR assays provide sensitive, practical, and cost-effective choices to the molecular diagnosis of the main diarrhoea-causing intestinal protists in clinical microbiology and research laboratories.This work was supported by the Health Institute Carlos III (PI19CIII/00029). A.D. received a pre-doctoral fellowship funded by the Health Institute Carlos III (FI20CIII/00002). H.A. received a Torres Quevedo research contract funded by the Spanish Ministry of Science, Innovation and Universities (PTQ018-009754). D.G.B. received a Sara Borrell research contract funded by the Spanish Ministry of Science, Innovation and Universities (CD19CIII/00011).S