La calcineurina en macrófagos: polarización y modulación de la respuesta inflamatoria.

Tesis doctoral inédita, leída en Universidad Autónoma de Madrad, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 25/04/2014La Calcineurina (CN) es una proteína fosfatasa dependiente de calcio y calmodulina (CaM) que defosforila residuos fosforilados de serina y treonina. Fue identificada como la diana de las drogas inmunosupresoras CsA y FK506, y desde entonces se ha estudiado ampliamente su función en la homeostasis del sistema inmune. La mayoría de estudios se han centrado en elucidar el papel de esta fosfatasa en las células T, sin embargo, los trabajos que han analizado su implicación en la función de los macrófagos son escasos. Los macrófagos, como mediadores clave del sistema inmune innato, determinan el curso de las respuestas inflamatorias; contribuyen al ambiente inflamatorio secretando citoquinas y quimioquinas y además pueden polarizarse influenciados por el contexto inflamatorio. Los macrófagos son células plásticas que pueden adoptar una gran variedad de fenotipos en respuesta a diferentes estímulos in vivo. In vitro, se han clasificado en dos fenotipos extremos: macrófagos M1, que presentan propiedades pro-inflamatorias y macrófagos M2, que ejercen funciones inmunomoduladoras o inmunosupresoras. En este trabajo de tesis, estudiamos el papel de la CN en la polarización de los macrófagos y analizamos su potencial como diana terapéutica para el tratamiento de enfermedades inflamatorias. Utilizando estrategias para el bloqueo específico de la señalización mediada por la CN, revelamos un papel de esta fosfatasa en la polarización de los macrófagos que no había sido descrito con anterioridad probablemente debido al uso de la CsA y el FK506 como inhibidores de la CN. Mostramos que la inhibición de la CN por el peptido LxVP o su deleción genética induce un fenotipo anti-inflamatorio en los macrófagos. Por el contrario,mostramos que el tratamiento con la CsA o el FK506 no provoca los mismos efectos. Investigamos la divergencia entre las diferentes estrategias de inhibición de la CN y encontramos que el LxVP y la deleción genética de la CN, pero no la CsA ni el FK506, inducen la fosforilación de la MAPK p38 a través de la inhibición de la expresión de la fosfatasa MKP-1. Además, evidenciamos el potencial antiinflamatorio del bloqueo específico de la CN en los macrófagos en los modelos murinos de artritis inducida por colágeno e hipersensibilidad por contacto inducida por oxazolona. Realizamos experimentos de terapia génica con lentivirus codificantes del peptido LxVP y también experimentos de terapia celular con macrófagos deficientes en la CN. Ambos tratamientos tuvieron un claro efecto terapéutico en el establecimiento y progreso de la respuesta inflamatoria. En este trabajo describimos una nueva función de la CN en la polarización de los macrófagos e identificamos una asociación entre la CN y la MAPK p38 en este proceso. También proponemos una estrategia alternativa de inhibición específica de la CN con potencial uso en el tratamiento de enfermedades inflamatorias.Calcineurin (CN) is a calcium dependent serine/threonine phosphatase. It was identified as the target of the immunosuppressants cyclosporin A and FK506 and since then, its involvement in the homeostasis of the immune system has been extensively analyzed. Most studies have been focused on the role of this phosphatase in T cells, however little is known about its implication in macrophage functionality. Macrophages, as key players of the innate immune system, determine the course of an inflammatory response; they contribute to the inflammatory environment by secreting cytokines and chemokines and also can be polarized influenced by the inflammatory context. Macrophages are plastic cells that adopt a large variety of phenotypes in response to different stimuli in vivo. In vitro, they have been classified into two extreme phenotypes: M1 macrophages, which present pro-inflammatory properties, and M2 macrophages which exert immunomodulatory and immunosuppresor effects. Here, we study the role of CN in macrophage polarization and also analyze the potential of CN as a macrophage-specific target for the treatment of inflammatory diseases. By using specific CN-targeting strategies we reveal a key role for CN in macrophage polarization that had not been previously revealed by the use of CsA or FK506 as CN-inhibitors. We show that CN-inhibition by the LxVP peptide or CN-gene deletion induces an antiinflammatory phenotype in macrophages. However, this does not occur upon CsA or FK506 treatment. We investigate this divergence between the different CN-targeting approaches and find that LxVP- and CN-gene deletion, but not CsA and FK506, induce p38 MAPK activation through the inhibition of MKP-1 expression, which in turn mediates the anti-inflammatory macrophage polarization. We also evidence the antiinflammatory potential of specifically targeting CN in macrophages in the murine models of collagen-induced arthritis and oxazolone-induced contact hypersensitivity. We perform gene therapy experiments with lentiviruses encoding the LxVP peptide and also cell therapy experiments with CN-inhibited macrophages. Both treatments result in a significant therapeutic effect in the onset or progression of the inflammatory responses. In this study we describe a novel role for CN in macrophage polarization and identify a link between CN and p38 MAPK in this process. We also propose alternative and more specific CN-targeting strategies for the treatment of inflammatory diseases