Tesis doctoral inédita, leída en Universidad Autónoma de Madrad, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 25/04/2014La Calcineurina (CN) es una proteína fosfatasa dependiente de calcio y
calmodulina (CaM) que defosforila residuos fosforilados de serina y treonina. Fue
identificada como la diana de las drogas inmunosupresoras CsA y FK506, y desde
entonces se ha estudiado ampliamente su función en la homeostasis del sistema
inmune. La mayoría de estudios se han centrado en elucidar el papel de esta fosfatasa
en las células T, sin embargo, los trabajos que han analizado su implicación en la
función de los macrófagos son escasos. Los macrófagos, como mediadores clave del
sistema inmune innato, determinan el curso de las respuestas inflamatorias;
contribuyen al ambiente inflamatorio secretando citoquinas y quimioquinas y además
pueden polarizarse influenciados por el contexto inflamatorio. Los macrófagos son
células plásticas que pueden adoptar una gran variedad de fenotipos en respuesta a
diferentes estímulos in vivo. In vitro, se han clasificado en dos fenotipos extremos:
macrófagos M1, que presentan propiedades pro-inflamatorias y macrófagos M2, que
ejercen funciones inmunomoduladoras o inmunosupresoras. En este trabajo de tesis,
estudiamos el papel de la CN en la polarización de los macrófagos y analizamos su
potencial como diana terapéutica para el tratamiento de enfermedades inflamatorias.
Utilizando estrategias para el bloqueo específico de la señalización mediada por la CN,
revelamos un papel de esta fosfatasa en la polarización de los macrófagos que no
había sido descrito con anterioridad probablemente debido al uso de la CsA y el
FK506 como inhibidores de la CN. Mostramos que la inhibición de la CN por el peptido
LxVP o su deleción genética induce un fenotipo anti-inflamatorio en los macrófagos.
Por el contrario,mostramos que el tratamiento con la CsA o el FK506 no provoca los
mismos efectos. Investigamos la divergencia entre las diferentes estrategias de
inhibición de la CN y encontramos que el LxVP y la deleción genética de la CN, pero
no la CsA ni el FK506, inducen la fosforilación de la MAPK p38 a través de la inhibición
de la expresión de la fosfatasa MKP-1. Además, evidenciamos el potencial antiinflamatorio
del bloqueo específico de la CN en los macrófagos en los modelos
murinos de artritis inducida por colágeno e hipersensibilidad por contacto inducida por
oxazolona. Realizamos experimentos de terapia génica con lentivirus codificantes del
peptido LxVP y también experimentos de terapia celular con macrófagos deficientes en
la CN. Ambos tratamientos tuvieron un claro efecto terapéutico en el establecimiento y
progreso de la respuesta inflamatoria. En este trabajo describimos una nueva función
de la CN en la polarización de los macrófagos e identificamos una asociación entre la
CN y la MAPK p38 en este proceso. También proponemos una estrategia alternativa
de inhibición específica de la CN con potencial uso en el tratamiento de enfermedades
inflamatorias.Calcineurin (CN) is a calcium dependent serine/threonine phosphatase. It was
identified as the target of the immunosuppressants cyclosporin A and FK506 and since
then, its involvement in the homeostasis of the immune system has been extensively
analyzed. Most studies have been focused on the role of this phosphatase in T cells,
however little is known about its implication in macrophage functionality. Macrophages,
as key players of the innate immune system, determine the course of an inflammatory
response; they contribute to the inflammatory environment by secreting cytokines and
chemokines and also can be polarized influenced by the inflammatory context.
Macrophages are plastic cells that adopt a large variety of phenotypes in response to
different stimuli in vivo. In vitro, they have been classified into two extreme phenotypes:
M1 macrophages, which present pro-inflammatory properties, and M2 macrophages
which exert immunomodulatory and immunosuppresor effects. Here, we study the role
of CN in macrophage polarization and also analyze the potential of CN as a
macrophage-specific target for the treatment of inflammatory diseases. By using
specific CN-targeting strategies we reveal a key role for CN in macrophage polarization
that had not been previously revealed by the use of CsA or FK506 as CN-inhibitors.
We show that CN-inhibition by the LxVP peptide or CN-gene deletion induces an antiinflammatory
phenotype in macrophages. However, this does not occur upon CsA or
FK506 treatment. We investigate this divergence between the different CN-targeting
approaches and find that LxVP- and CN-gene deletion, but not CsA and FK506, induce
p38 MAPK activation through the inhibition of MKP-1 expression, which in turn
mediates the anti-inflammatory macrophage polarization. We also evidence the antiinflammatory
potential of specifically targeting CN in macrophages in the murine
models of collagen-induced arthritis and oxazolone-induced contact hypersensitivity.
We perform gene therapy experiments with lentiviruses encoding the LxVP peptide and
also cell therapy experiments with CN-inhibited macrophages. Both treatments result in
a significant therapeutic effect in the onset or progression of the inflammatory
responses. In this study we describe a novel role for CN in macrophage polarization
and identify a link between CN and p38 MAPK in this process. We also propose
alternative and more specific CN-targeting strategies for the treatment of inflammatory
diseases