Herpesvirus bovino 4 (BoHV-4) : isolamento e caracterizaação, desenvolvimento de Elisa Indireto para diagnóstico

Orientadora : Profa. Dra. Vanete Thomaz SoccolTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Processos Biotecnológicos. Defesa: Curitiba, 16/01/2012Bibliografia: fls. 77-87Área de concentração: Saúde humana e animalResumo: BoHV-4 é membro da sub-família Gammaherpesvirinae, gênero Rhadinovirus e está associado a diversas manifestações clínicas, em que estudos demonstram uma forte correlação entre infecção por este vírus com metrite pós-parto e aborto em bovinos. Objetivos: este trabalho teve por propósito caracterizar uma amostra viral isolada a partir de secreção uterina de fêmea de bovino e desenvolver técnica de ensaio imunoenzimático - ELISA indireto - para detecção de anticorpos específicos ao BoHV-4 em soros procedentes de treze diferentes estados brasileiros. Material e Métodos: a partir de swabs colhidos de secreção uterina a amostra de vírus isolada foi caracterizada pela citopatologia, morfologia e biologia molecular. Um teste ELISA indireto foi desenvolvido, avaliado e utilizado para pesquisa de anticorpos. Resultados: houve presença de efeito citopático em que a emissão de longos filamentos com pequenos balões ao longo destes foi característica distintiva. Na microscopia eletrônica, a existência de partículas virais com capsídeos com simetria icosaédrica e envelope mostraram-se típicas de Herpesvírus. Na identificação por PCR o produto obtido apresentou 2571 pb, cuja digestão com Hind III gerou fragmentos com 403, 420, 535 e 1125 bp. Do corte do genoma com enzimas de restrição, Hind III e Bam HI, obteve-se as chamadas bandas diagnósticas e a presença de banda hipermolar com 2350 pb, demonstrando ser Herpesvírus bovino-4, pertencente ao grupo DN-599. A padronização da técnica ELISA apresentou resultados diferenciando entre positivo e negativo com os seguintes parâmetros: concentração de antígeno de 5 ?g por poço; diluição de soro 1:25 e diluição do conjugado 1:1600 ou 1:3200. Com a sorologia realizada em bovinos, evidenciou-se a presença de anticorpos em soros procedentes de todos os estados examinados. Conclusão: como já descrito em outros países, em nosso meio o BoHV-4 também está associado a metrite pós-parto, que infecta rebanhos em todos os estados examinados. Em alguns a situação é enzoótica. Metrite pós-parto afeta aproximadamente 40% dos bovinos e a participação deste agente viral como causa de aborto ainda não está incluída nas rotinas de diagnóstico no Brasil. Espera-se com este trabalho despertar a consciência profissional para a participação viral nas enfermidades uterinas de bovinos.Abstract:BoHV-4 is a member of Gammaherpesvirinae sub-family and belongs to genus Rhadinovirus. This virus has been associated to different clinical manifestations and a research activity has put forward an strong correlation among virus infection, postpartum metritis and abortion. Objectives: these works had as major goals to characterize a virus strain isolate from a cow's uterine outflow and the development of an immunoenzimatic assay, indirect ELISA, in order to detect specific antibodies to BoHV-4, in sera harvested from 13 different brazilian states. Material and Methods: from swabs drawn of an uterine secretion a virus strain was isolated and characterized by its cytopathology, morphology and molecular biology aspects. An indirect ELISA was developed, evaluated and utilized to search for BoHV-4 antibodies. Results: there was CPE development, characterized mainly by long strands with several small balloons along them, radiated from infected cells. Electron microscopy analysis revealed virus particles which had icosahedrical capsid symmetry surrounded by a loose envelope, typical of a Herpesvirus. A 2571 bp PCR product, which after Hind III digestion generated four fragments, whose base pair composition were 403,420,535 and 1125 bp. Restriction enzymes Hind III and Bam HI generated the expected diagnostic bands, as well as, a 2350 bp hypermolar fragment, as result of Bam HI treatment, to demonstrate that agent was a bovine Herpesvirus 4, appertaining to DN-599 group. Works done in order to have ELISA methodology under control, such as antigen concentration at ± 5 ?g/well, conjugate dilution 1:1600 or 1:3200 and sera dilution at 1:25, allowed sera categorization as positive, negative or gray zone. Antibodies to BoHV-4 were found in sera from all states screened. Conclusion: as has been described in several countries, in Brazil, also, BoHV-4 is associated to postpartum metritis in cows, and the virus infects herds distributed throughout the states that were under evaluation. Postpartum metritis affects approximately 40% of bovine population, and this viral agent as abortion cause still is not included in Brazil's diagnostic routine. We hope to highlight the participation of viral infections in bovine uterus diseases, in order to get a better professional consciousness

ASPECTOS ETIOLÓGICOS E EPIDEMIOLÓGICOS DO ABORTO EQÜINO

Para a investigação das causas de aborto eqüino na região de Curitiba, realizou-se a coleta e processamento do material de casos de aborto para bacteriologia, virologia e histologia; e um levantamento estatístico geral dos casos de aborto. Durante três anos, foram acompanhadas 674 gestações, das quais 9,2% resultaram em aborto. Com relação a abortos gemelares, verificou-se um índice de 4,5% em um total de 132 casos analisados. O material de 21 fetos foi processado com o intuito de isolar-se o Herpesvírus eqüino tipo 1, obtendo-se o isolamento em 4 casos (19,0%). Foram examinados para bacteriologia um total de 38 fetos, dos quais 44,7% foram considerados bacteriologicamente positivos. As bactérias isoladas com maior freqüência foram: Streptococcus spp., Klebsiella spp., Escherichia coli, Pseudomonas spp. e Staphylococcus spp.. Foram descritas as alterações encontradas no exame histológico da maioria dos casos de aborto de origem bacteriana e viral. Abstract This research was undertaken with the aim of establishing the main causes of equine abortion in the Curitiba area. It has been established that during the period of three years occurred a total of 9.2 per cent abortions among 674 gestations studied. From 50 aborted fetuses, different biological material was collected for bacteriology, virus and histopathology analysis. A total of 4.5 per cent of twin abortions were observed among 132 cases of abortions studied. The equine Herpesvirus type 1 has been successfully isolated from 4 cases, among 21 fetuses studied. On the other hand, 44.7 per cent from 38 fetuses studied were considered positive for bacteriological testing. The most frequent bacteria recovered were Streptococcus spp., Klebsiella spp., Escherichia coli, Pseudomonas spp. and Staphylococcus spp. The alterations found in the histological examination of the majority of bacteriological and virological abortion cases were desccribed

Herpesvirus bovino 4 (BoHV-4) : isolamento e caracterizaação, desenvolvimento de Elisa Indireto para diagnóstico

Orientadora : Profa. Dra. Vanete Thomaz SoccolTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Processos Biotecnológicos. Defesa: Curitiba, 16/01/2012Bibliografia: fls. 77-87Área de concentração: Saúde humana e animalResumo: BoHV-4 é membro da sub-família Gammaherpesvirinae, gênero Rhadinovirus e está associado a diversas manifestações clínicas, em que estudos demonstram uma forte correlação entre infecção por este vírus com metrite pós-parto e aborto em bovinos. Objetivos: este trabalho teve por propósito caracterizar uma amostra viral isolada a partir de secreção uterina de fêmea de bovino e desenvolver técnica de ensaio imunoenzimático - ELISA indireto - para detecção de anticorpos específicos ao BoHV-4 em soros procedentes de treze diferentes estados brasileiros. Material e Métodos: a partir de swabs colhidos de secreção uterina a amostra de vírus isolada foi caracterizada pela citopatologia, morfologia e biologia molecular. Um teste ELISA indireto foi desenvolvido, avaliado e utilizado para pesquisa de anticorpos. Resultados: houve presença de efeito citopático em que a emissão de longos filamentos com pequenos balões ao longo destes foi característica distintiva. Na microscopia eletrônica, a existência de partículas virais com capsídeos com simetria icosaédrica e envelope mostraram-se típicas de Herpesvírus. Na identificação por PCR o produto obtido apresentou 2571 pb, cuja digestão com Hind III gerou fragmentos com 403, 420, 535 e 1125 bp. Do corte do genoma com enzimas de restrição, Hind III e Bam HI, obteve-se as chamadas bandas diagnósticas e a presença de banda hipermolar com 2350 pb, demonstrando ser Herpesvírus bovino-4, pertencente ao grupo DN-599. A padronização da técnica ELISA apresentou resultados diferenciando entre positivo e negativo com os seguintes parâmetros: concentração de antígeno de 5 ?g por poço; diluição de soro 1:25 e diluição do conjugado 1:1600 ou 1:3200. Com a sorologia realizada em bovinos, evidenciou-se a presença de anticorpos em soros procedentes de todos os estados examinados. Conclusão: como já descrito em outros países, em nosso meio o BoHV-4 também está associado a metrite pós-parto, que infecta rebanhos em todos os estados examinados. Em alguns a situação é enzoótica. Metrite pós-parto afeta aproximadamente 40% dos bovinos e a participação deste agente viral como causa de aborto ainda não está incluída nas rotinas de diagnóstico no Brasil. Espera-se com este trabalho despertar a consciência profissional para a participação viral nas enfermidades uterinas de bovinos.Abstract:BoHV-4 is a member of Gammaherpesvirinae sub-family and belongs to genus Rhadinovirus. This virus has been associated to different clinical manifestations and a research activity has put forward an strong correlation among virus infection, postpartum metritis and abortion. Objectives: these works had as major goals to characterize a virus strain isolate from a cow's uterine outflow and the development of an immunoenzimatic assay, indirect ELISA, in order to detect specific antibodies to BoHV-4, in sera harvested from 13 different brazilian states. Material and Methods: from swabs drawn of an uterine secretion a virus strain was isolated and characterized by its cytopathology, morphology and molecular biology aspects. An indirect ELISA was developed, evaluated and utilized to search for BoHV-4 antibodies. Results: there was CPE development, characterized mainly by long strands with several small balloons along them, radiated from infected cells. Electron microscopy analysis revealed virus particles which had icosahedrical capsid symmetry surrounded by a loose envelope, typical of a Herpesvirus. A 2571 bp PCR product, which after Hind III digestion generated four fragments, whose base pair composition were 403,420,535 and 1125 bp. Restriction enzymes Hind III and Bam HI generated the expected diagnostic bands, as well as, a 2350 bp hypermolar fragment, as result of Bam HI treatment, to demonstrate that agent was a bovine Herpesvirus 4, appertaining to DN-599 group. Works done in order to have ELISA methodology under control, such as antigen concentration at ± 5 ?g/well, conjugate dilution 1:1600 or 1:3200 and sera dilution at 1:25, allowed sera categorization as positive, negative or gray zone. Antibodies to BoHV-4 were found in sera from all states screened. Conclusion: as has been described in several countries, in Brazil, also, BoHV-4 is associated to postpartum metritis in cows, and the virus infects herds distributed throughout the states that were under evaluation. Postpartum metritis affects approximately 40% of bovine population, and this viral agent as abortion cause still is not included in Brazil's diagnostic routine. We hope to highlight the participation of viral infections in bovine uterus diseases, in order to get a better professional consciousness

FREQÜÊNCIA DE ANTICORPOS NEUTRALIZANTES CONTRA O HERPESVÍRUS EQÜINO TIPO 1

This survey is a part of a research that was undertaken with the aim of establishing the main causes of equine abortion in the Curitiba area. A serological survey for equine herpesvirus type 1 was carried out in 299 animals, until 1992. All equines studied were non-vaccinated against rhinopneumonitis, from both sexes and from different ages, beginning with one-year-old animals. From the total of animals studied, 17.7 per cent were positive for equine herpesvirus type 1 antibodies, which were studied by means of the serum neutralization test. These data were analyzed in regard to the age, sex, breed and the animals environment. It was observed that animals from one to four years old displayed increasing tendency for serum positivity, with the age advancement. The presence of neutralizing antibodies against equine herpesvirus type 1, in non-vaccinated animals, proves the existence of the above-mentioned virus in the studied population.Como parte da investigação das causas de aborto eqüino na região de Curitiba - PR e com o objetivo de determinar o grau de exposição do rebanho ao herpesvírus eqüino tipo 1, foi utilizada a técnica de soroneutralização. Foram colhidas, até o ano de 1992, 299 amostras de soro sangüíneo de animais a partir de um ano de idade, não vacinados contra rinopneumonite, dos quais 17,7% apresentaram anticorpos para o referido vírus. Não foram encontradas diferenças, estatisticamente, significantes com relação à soropositividade entre os animais agrupados segundo o sexo, raça ou procedência. Apenas com relação à faixa etária, observou-se que os animais de um a quatro anos, apresentaram tendência ao aumento de soropositividade com o avanço da idade. A presença de anticorpos soroneutralizantes contra o herpesvírus eqüino tipo 1, em animais não vacinados, comprova a existência do referido vírus na população estudada

Development and Evaluation of an Indirect ELISA: Serological Survey to Detect Specific Antibodies to Bovine Herpesvirus 4

ABSTRACTThe aim of this work was to develop and evaluate an indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and made a serological screening for specific antibodies to BoHV-4. Bovine serum samples were collected from different Brazilian states and evaluated for the presence of antibodies for BoHV-4 and BoHV-1. The serological results obtained showed that the indirect ELISA assay could be applied for the detection of specific antibodies for BoHV-4. The ELISA test allowed concluding that BoHV-4 is present in bovines in every Brazilian state from which serum samples were collected. The ELISA assay here standardized proved to be useful for the epidemiological studies and showed a positivity range from 1.8 to 66% in Brazil

Production and characterization of monoclonal antibodies anti fragment Fc of bovine IgG

The aim of this work was to produce and characterize monoclonal antibodies anti bovine immunoglobulin G (IgG). Out of seven hybridomas, two were chosen based on the ELISA'S absorbance values and were labeled B4F11 and B3H12. These monoclonals were analyzed through Western Blot for IgG fragments obtained by proteolysis with papain, separated by electrophoresis in polyacrylamide gel electrophoresis with β-mercaptoetanol as reducing agent. This revealed that, possibly, the B4F11 was directed to a conformational antigen, and that B3H12 reacted in a specific fashion with Fc (Bovine IgG crystallizable fragment). This antibody could be used in the development of reagents to immunoassays relevant for research and diagnosis.No Brasil, anticorpos anti-espécie específica usados em métodos de diagnóstico geralmente são importados, aumentando o custo das análises. Visando produzir insumos para métodos diagnóstico por enzimaimunoensaio, o presente trabalho teve como objetivo produzir e caracterizar anticorpos monoclonais anti imunoglobulina G (IgG) bovina. De sete hibridomas obtidos e que apresentaram valores relevantes de absorbância em teste imunoenzimático (ELISA indireta), dois clones com melhor performance foram selecionados e designados B4F11 e B3H12. Estes anticorpos monoclonais foram analisados em Western Blot para reatividade com fragmentos de IgG bovina, obtidos por proteólise com papaína e separados por eletroforese em gel de poliacrilamida, com presença do agente redutor beta-mercaptoetanol. A eletroforese mostrou que o anticorpo B4F11, foi direcionado para um antígeno conformacional, e que o monoclonal B3H12 reagiu especificamente com a porção Fc da IgG bovina (fragmento cristalizável). Este anticorpo será utilizado no desenvolvimento de reagentes para imunoensaios de interesse à pesquisa e diagnósticos