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Chromosome dynamics in Bacillus subtilis -Characterization of the Structural Maintenance of Chromosomes (SMC) complex
Alle Zellen mĂŒssen ihr Erbmaterial verdoppeln und
dafĂŒr Sorge tragen, daĂ jede Tochterzelle einen kompletten Satz
des Erbguts vor der Zellteilung erhĂ€lt. In Bakterien mĂŒssen die
Chromosomen organisiert und kompaktiert werden, wÀhrend sie
gleichzeitig dynamisch sein mĂŒssen, um laufende zellulĂ€re
Prozesse wie DNA Reparatur, Rekombination, Transktiption und
Replikation zu ermöglichen. SMC (Structural Maintenance of
Chromosome) Proteine bilden eine ubiquitÀre Proteinfamilie, die
eine zentrale Rolle in verschiedenen Chromosomendynamiken
spielt. Das Hauptaugenmerk in dieser Arbeit ruht auf der
Charakterisierung der SMC Proteine und ihrer Partner aus
Bacillus subtilis. Genbanksuchen haben zu der Identifizierung
zweier Interaktionspartner des SMC Proteins gefĂŒhrt. Diese
Proteine, ScpA und ScpB, sind in Bakterien und Archaen
konserviert. Die Deletion des scpA oder des scpB Gens fĂŒhrte zu
einem der smc Deletionsmutante Àhnlichen PhÀnotyp, d.h.
temperatursensitivem langsamen Wachstum (unterhalb 23°C),
dekondensierten Nukleoiden (zellulÀre Struktur der Chromosomen)
und einem ausgeprÀgten Segregationsdefekt. Die gleichzeitige
Deletion der Gene erzeugte keinen verÀnderten PhÀnotyp, was
zeigt, dass alle drei Proteine im gleichen Aspekt der
Chromosomen-Kondensation und Segregation fungieren. Um ihre
Funktion in vivo zu untersuchen, wurden die Proteine in Zellen
mit Hilfe von voll funktionellen GFP Fusionen lokalisiert. Alle
drei Proteine bildeten diskrete Foci in den Zellen, einem bis
dato unbekannten Lokalisationsmuster, das sich dynamisch
wÀhrend des Zellzyklus verÀnderte: zu Beginn des Zellzyklus
befanden sich die Foci in der Zellmitte, und nach der
Verdopplung des Focus wanderten die beiden Foci rasch
entgegengesetzt in Richtung der Zellpole. In diesen bipolaren
Foci verblieben die drei Proteine fĂŒr den Rest des Zellzyklus.
Die Bildung des Proteinkomplexes konnte durch Fluoreszenz
Resonanz Energie Transfer (FRET) und durch Depletionsstudien
belegt werden. So konnte die Bildung der Foci nur in
Anwesenheit aller Proteine beobachtet werden, nicht jedoch in
Abwesenheit eines der drei Proteine. Die spezifische
Lokalisierung des SMC Komplex hing auch von fortlaufender DNA
Replikation ab, von zellulÀrer Gyrase AktivitÀt (d.h. von der
Struktur der DNA), sowie von der ATPase-AktivitÀt von SMC. Die
Ăberproduktion von SMC fĂŒhrte zu einer Ăber-Kondensation der
Nukleoide, wobei die Lokalisation des SMC Komplexes erhalten
blieb, was darauf hin deutet, daĂ die beobachteten Foci aktive
Kondensationszentren darstellen. Weiterhin zeigten die Proteine
des SMC Komplex wachstumsabhÀngige Expression. SMC und ScpB
waren nur in wachsenden Zellen vorhanden, und wurden rasch beim
Ăbergang in die StatonĂ€rphase abgebaut. Die Analyse der RNA
Mengen in verschiedenen Wachstumsphasen durch Primer
Extensionsanalyse zeigte, daĂ das smc Transkript im Ăbergang
zur StationÀrphase nicht abnimmt. Diese Experimente zeigten
einen bisher nicht identifizierten smc Promotor auf, und
erbrachten den Nachweis, daĂ SMC posttranskriptionell reguliert
wird. Die smc, scpA, und scpB Deletionsmutanten wiesen
ebenfalls eine ausgeprĂ€gte SensitivitĂ€t gegenĂŒber Mitomycin C
(MMC) auf, welches DoppelstrangbrĂŒche (DSBs) in die DNA
einfĂŒhrt. Demnach wird der SMC Komplex ebenfalls fĂŒr die
Reparatur von DSBs benötigt. Weiterhin wurde die Funktion des
SMC Proteins YirY untersucht, welches homolog zum DNA Reparatur
Protein SbcC aus Escherichia coli ist. Die yirY Deletion fĂŒhrte
ebenfalls zu einer deutlichen SensitivitÀt zu MMC, was eine
Rolle in der DSB Reparatur belegt. In MMC behandelten Zellen
bildete YirY Foci auf der DNA, welche aktive DSB
Reparaturzentren darstellen könnten. In Gegensatz dazu waren
die anderen Proteine aus dem gleichen Operon, AddA, AddB, and
SbcD ĂŒberall in den Zellen vorhanden und bildeten keine
speziellen Strukturen, was darauf hindeutet, daĂ SbcC und AddAB
in verschiedenen Reparaturwegen fungieren. Die subzellulÀre
Lokalisation der Topoisomerase IV Untereinheiten ParC und ParE
wurde ebenfalls in dieser Arbeit beleuchtet. ParC lokalisierte
auf dem gesamten Nukleoid, ganz im Gegenteil zu einer frĂŒheren
Studie, in der ParC ausschlieĂlich in der NĂ€he der Zellpole
vorhanden war, wonach ParC eine spezialisierte Rolle bei der
Dekatenierung von Chromosomen zugesprochen wurde. Durch
Ăberproduktion von ParC und ParE wurden die Nukeloide noch
stÀrker kompaktiert, was zusammen mit der Lokalisierung eine
generelle Rolle in der Chromosomenkompaktierung belegt.
Insgesamt lĂ€Ăt sich schluĂfolgern, daĂ die Lokalisation von
Proteinen, die an der Chromosomensegregation, DNA Reparatur und
Translation beteiligt sind, ein wesendlich definierteres Bild
der rÀumlichen Funktion der Proteine in lebenden Bakterien
erbrachte
Untersuchungen zur generellen Stressantwort von Bacillus subtilis nach Einwirkung von Umweltstress und bei niedriger Temperatur
Zusammenfassung
Der alternative Sigmafaktor SigB
kontrolliert die Expression des generellen Stressregulons in
Bacillus subtilis. Durch die Synthese von generellen
Stressproteinen werden nicht-wachsende B. subtilis-Zellen mit
einer unspezifischen, vielfÀltigen und vorsorgenden Resistenz
gegen zukĂŒnftigen Stress ausgestattet.
Um die Funktion der
generellen Stressantwort im Adaptationsnetzwerk dieses
Gram-positiven Modellorganismus besser zu verstehen, wurden die
VerÀnderungen im Transkriptom nach Einwirkung von Hitze, Salz
und Ethanolstress analysiert. Diese Studie wurde mit
DNA-Makroarrays durchgefĂŒhrt, auf die PCR-Produkte aller 4107
Gene gespottet waren. Insgesamt konnten 124 SigB-abhÀngige Gene
identifiziert werden. Darunter wurden 62 Gene neu dem
SigB-Regulon zugeordnet und 62 schon zuvor beschriebene
SigB-abhÀngige Gene bestÀtigt. Die genomweite Betrachtung des
Transkriptionsprofils nach Umweltstress erlaubte auch eine
Analyse der spezifischen Stressantworten von B. subtilis auf
Hitze-, Salz- und Ethanolstress. Neu war die Induktion des
ECF-Sigmafaktors SigW und seines Regulons nach 4% Salzstress.
In ?dot blot?-Experimenten konnte gezeigt werden,
dass die Induktion des SigW-Regulons osmotisch bedingt war.
AuĂerdem wurde die Induktion der generellen Stressantwort bei
niedriger Temperatur untersucht. Mit SigB-abhÀngigen LacZ- und
GFP-Reporterfusionen konnte der Induktionsverlauf des
SigB-Regulons in der KÀlte beobachtet werden. Bei 37 °C wird
das SigB-Regulon nach Umweltstress sofort, aber transient
induziert. In der KĂ€lte war dagegen eine langanhaltende
Induktion der ctc::lacZ-Reporterfusion in der exponentiellen
Phase zu sehen. Nach einem Maximum in der exponentiellen
Wachstumsphase fiel die Induktion bis zum Ăbergang in die
stationÀre Phase langsam wieder ab, um dann auf einem erhöhten
Level zu stagnieren.
Die Analyse verschiedener
Regulatormutanten der SigB-AktivitÀt bestÀtigte den
temperatursensitiven PhÀnotyp einer sigB-Mutante und
dokumentierte die Wachstumsdefekte einer rsbP-Mutante und einer
rsbUP-Mutante bei 15 °C, die vermutlich durch die schwache
Induktion des SigB-Regulons in diesen Zellen verursacht waren.
So stellte eine zusĂ€tzliche Deletion des Gens fĂŒr den
Anti-Antisigmafaktor RsbV in der rsbUP-Mutante die volle
Induktion der Reporterfusion wieder her, wodurch ebenfalls der
Wachstumsdefekt aufgehoben wurde. Die intensive, langanhaltende
Induktion des generellen Stressregulons in der
rsbUPV-Tripelmutante unterstĂŒtzt die These eines neuen
Signaltransduktionsweges zur Aktivierung von SigB in der KĂ€lte.
In weiteren Arbeiten wird zu klÀren sein, ob in die Aktivierung
von SigB in der KĂ€lte weitere Proteine einbezogen sind oder fĂŒr
die Aktivierung eine intrinsische InstabilitÀt des
RsbW/SigB-Komplexes verantwortlich ist
Charakterisierung der molekularen Determinanten zur hochaffinen Bindung der kompatiblen Soluten Glycin Betain, Prolin Betain, Ectoin und Hydroxyectoin durch Substratbindeproteine von bakteriellen ABC-Transportern
Die Akkumulation von kompatiblen Soluten ist ein weit verbreiteter Schutzmechanismus gegen variierende Umweltbedingungen und wird in vielen Spezies der Bacteria und Archaea verwendet. Das einige kompatible Solute nicht nur osmoprotektive Wirkung haben, sondern generell Protein-stabilisierende Substanzen sind, ist durch in vitro Experimente belegt. Der Protein-stabilisierende Effekt wird in dem âpreferential exclusion modelâ beschrieben und beruht auf dem thermodynamisch begrĂŒndeten, bevorzugten AusschluĂ der Solute von der OberflĂ€che der Proteine.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Substratbindeproteine zweier hochaffiner ABC-Transporter fĂŒr die kompatiblen Solute Glycin Betain und Prolin Betain auf molekularer Ebene untersucht, um die Grundlagen zur Bindung von âbevorzugt ausgeschlossenen Solutenâ zu beschreiben. Dazu wurden die beiden hochaufgelösten Kristallstrukturen der Substratbindeproteine aus dem ProU-System von E. coli (EcProX, 1,6 Ă
) und dem ProU-System von A. fulgidus (AfProX 1,9 Ă
) verwendet. In EcProX wird das quartĂ€re Amin des gebundenen Glycin Betains durch eine Box von drei Tryptophanen koordiniert (Trp-65, Trp-140 und Trp-188), die Carboxylgruppe des Glycin Betains wird durch H-BrĂŒcken stabilisiert. In einer Mutagenestudie konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Kation-pi-Interaktionen eine Haupt-Determinante in der Bindung von Glycin Betain sind. Es konnte gezeigt werden, dass neben Tryptophan auch Phenylalanin und Tyrosin zu starken Interaktionen mit dem Substrat fĂ€hig sind. Die Mutagenesestudie demonstrierte eine unterschiedlich starke Beteiligung der Tryptophane an der Substratbindung. Trp-188 ist dabei essentiell fĂŒr die Bindung von Glycin Betain, Trp-140 zeigte die geringste Beteiligung. Trp-188 benötigt die Tryptophane Trp-140 und Trp-65 aber zur Stabilisierung des quartĂ€ren Amins von Glycin Betain in der Bindetasche.
Das AfProX Protein zeigt in AffinitĂ€tsmessungen eine besonders hohe AffinitĂ€t zu Glycin Betain und Prolin Betain. Verglichen mit dem EcProX Protein ist die KD von AfProX zu Glycin Betain bei 50°C (0,01 ”M) um den Faktor 100 niedriger als die des EcProX Proteins bei Raumtemperatur (KD=1”M) und um den Faktor 1000 niedriger verglichen zum OpuAC Protein (KD=17 ”M), einem Glycin Betain und Prolin Betain bindenden Protein aus B. subtilis. In der Kristallstruktur von AfProX zeigte sich eine weitere Konstellation einer aromatischen Bindetasche. Das quartĂ€re Amin wird dort von den vier Tyrosinen Tyr-63, Tyr-111, Tyr-190 und Tyr-214 (Tyrosin-GĂŒrtel) und einem Aspartat koordiniert, die Carboxylgruppe wird durch Salz- und H-BrĂŒcken stabilisiert. Eine Mutagenesestudie zeigte auch hier die wichtige Beteiligung von Kation-pi-Interaktionen an der hochaffinen Bindung dieser kompatiblen Solute. Dabei ist die besondere Architektur des Tyrosin-GĂŒrtels, zusammen mit den Carboxylgruppen-stabilisierenden AminosĂ€uren, essentiell fĂŒr die hohe BindeaffinitĂ€t. Je nach Position des Tyrosins kann der Austausch eines Tyrosins gegen ein Alanin das Absinken der Bindekonstante auf einen Wert, vergleichbar zu dem des EcProX- oder des BsOpuAC-Proteins, oder niedriger bewirken. Ein Austausch von zwei Tyrosinen gegen Alanin bedeutet immer einen kompletten Verlust der BindeaffinitĂ€t. Datenbankanalysen der AminosĂ€uresequenzen von EcProX, AfProX und BsOpuAC zeigten eine weite Verbreitung der konservierten Bindemotive der Proteine und im Falle von BsOpuAC eine besonders starke Konservierung der bindungsrelevanen Tryptophane (âTrp-Prismaâ) sowie einen DomĂ€nentausch im Vergleich zu anderen Glycin Betain Bindeproteinen.
Die Entdeckung eines Substratbindeprotein-abhĂ€ngigen ABC-Transporters (Ehu) fĂŒr Ectoin und Hydroxyectoin in S. meliloti erlaubte die Analyse der Ectoin-Bindung durch ein Substratbindeprotein. Nach der Ăberproduktion, Reinigung und Charakterisierung des hochaffinen Ectoin-Bindeproteins (EhuB) und dessen Kristallistation mit gebundenem Ectoin (und Hydroxyectoin) zeigte die Struktur (Auflösung 2,1 Ă
) in der Substratbindestelle eine aromatische Box aus zwei Phenylalaninen und einem Tyrosin, welche die delokalisierte positive Ladung des MolekĂŒls binden. Der Pyrimidinring und die Carboxylgruppe des Ectoins werden durch Salz- und H-BrĂŒcken stabilisiert.
Kation-pi-Interaktionen sind eine Hauptdeterminate in der hochaffinen Bindung von Glycin Betain und Prolin Betain, aber auch von Ectoin und Hydroxyectoin und finden eine weite Verbreitung in den Bacteria und Archaea
The GbsR Family of Transcriptional Regulators: Functional Characterization of the OpuAR Repressor
Accumulation of compatible solutes is a common stress response of microorganisms challenged by high osmolarity; it can be achieved either through synthesis or import. These processes have been intensively studied in Bacillus subtilis, where systems for the production of the compatible solutes proline and glycine betaine have been identified, and in which five transporters for osmostress protectants (Opu) have been characterized. Glycine betaine synthesis relies on the import of choline via the substrate-restricted OpuB system and the promiscuous OpuC transporter and its subsequent oxidation by the GbsAB enzymes. Transcription of the opuB and gbsAB operons is under control of the MarR-type regulator GbsR, which acts as an intracellular choline-responsive repressor. Modeling studies using the X-ray structure of the Mj223 protein from Methanocaldococcus jannaschii as the template suggest that GbsR is a homo-dimer with an N-terminal DNA-reading head and C-terminal dimerization domain; a flexible linker connects these two domains. In the vicinity of the linker region, an aromatic cage is predicted as the inducer-binding site, whose envisioned architecture resembles that present in choline and glycine betaine substrate-binding proteins of ABC transporters. We used bioinformatics to assess the phylogenomics of GbsR-type proteins and found that they are widely distributed among Bacteria and Archaea. Alignments of GbsR proteins and analysis of the genetic context of the corresponding structural genes allowed their assignment into four sub-groups. In one of these sub-groups of GbsR-type proteins, gbsR-type genes are associated either with OpuA-, OpuB-, or OpuC-type osmostress protectants uptake systems. We focus here on GbsR-type proteins, named OpuAR by us, that control the expression of opuA-type gene clusters. Using such a system from the marine bacterium Bacillus infantis, we show that OpuAR acts as a repressor of opuA transcription, where several compatible solutes (e.g., choline, glycine betaine, proline betaine) serve as its inducers. Site-directed mutagenesis studies allowed a rational improvement of the putative inducer-binding site in OpuAR with respect to the affinity of choline and glycine betaine binding. Collectively, our data characterize GbsR-/OpuAR-type proteins as an extended sub-group within the MarR-superfamily of transcriptional regulators and identify a novel type of substrate-inducible import system for osmostress protectants
Microseeding â A Powerful Tool for Crystallizing Proteins Complexed with Hydrolyzable Substrates
Hydrolysis is an often-encountered obstacle in the crystallization of proteins complexed with their substrates. As the duration of the crystallization process, from nucleation to the growth of the crystal to its final size, commonly requires several weeks, non-enzymatic hydrolysis of an âunstableâ ligand occurs frequently. In cases where the crystallization conditions exhibit non neutral pH values this hydrolysis phenomenon may be even more pronounced. ChoX, the substrate binding protein of a choline ABC-importer, produced crystals with its substrate acetylcholine after one month. However, these crystals exhibited only choline, an acetylcholine hydrolysis product, in the binding site. To overcome this obstacle we devised a microseeding protocol leading to crystals of ChoX with bound acetylcholine within 24 hours. One drawback we encountered was the high twinning fraction of the crystals, possibly was due to the rapid crystal growth
Compatible Solute Synthesis and Import by the Moderate Halophile Spiribacter salinus: Physiology and Genomics
Members of the genus Spiribacter are found worldwide and are abundant in ecosystems possessing intermediate salinities between seawater and saturated salt concentrations. Spiribacter salinus M19-40 is the type species of this genus and its first cultivated representative. In the habitats of S. salinus M19-40, high salinity is a key determinant for growth and we therefore focused on the cellular adjustment strategy to this persistent environmental challenge. We coupled these experimental studies to the in silico mining of the genome sequence of this moderate halophile with respect to systems allowing this bacterium to control its potassium and sodium pools, and its ability to import and synthesize compatible solutes. S. salinus M19-40 produces enhanced levels of the compatible solute ectoine, both under optimal and growth-challenging salt concentrations, but the genes encoding the corresponding biosynthetic enzymes are not organized in a canonical ectABC operon. Instead, they are scrambled (ectAC; ectB) and are physically separated from each other on the S. salinus M19-40 genome. Genomes of many phylogenetically related bacteria also exhibit a non-canonical organization of the ect genes. S. salinus M19-40 also synthesizes trehalose, but this compatible solute seems to make only a minor contribution to the cytoplasmic solute pool under osmotic stress conditions. However, its cellular levels increase substantially in stationary phase cells grown under optimal salt concentrations. In silico genome mining revealed that S. salinus M19-40 possesses different types of uptake systems for compatible solutes. Among the set of compatible solutes tested in an osmostress protection growth assay, glycine betaine and arsenobetaine were the most effective. Transport studies with radiolabeled glycine betaine showed that S. salinus M19-40 increases the pool size of this osmolyte in a fashion that is sensitively tied to the prevalent salinity of the growth medium. It was amassed in salt-stressed cells in unmodified form and suppressed the synthesis of ectoine. In conclusion, the data presented here allow us to derive a genome-scale picture of the cellular adjustment strategy of a species that represents an environmentally abundant group of ecophysiologically important halophilic microorganisms.España Ministerio de EconomĂa y Competitividad CGL2013-46941-P and CGL2017-83385-
Stress-induced activation of the proline biosynthetic pathway in Bacillus subtilis:A population-wide and single-cell study of the osmotically controlled proHJ promoter
Bacillus subtilis, in its natural habitat, is regularly exposed to rapid changes in the osmolarity of its surrounding. As its primary survival strategy, it accumulates large amounts of the compatible solute proline by activating the de novo proline biosynthesis pathway and exploiting the glutamate pools. This osmotically-induced biosynthesis requires activation of a SigA-type promoter that drives the expression of the proHJ operon. Population-wide studies have shown that the activity of the proHJ promoter correlates with the increased osmotic pressure of the environment. Therefore, the activation of the proHJ transcription should be an adequate measure of the adaptation to osmotic stress through proline synthesis in the absence of other osmoprotectants. In this study, we investigate the kinetics of the proHJ promoter activation and the early adaptation to mild osmotic upshift at the single-cell level. Under these conditions, we observed a switching point and heterogeneous proline biosynthesis gene expression, where the subpopulation of cells showing active proHJ transcription is able to continuously divide, and those unresponsive to osmotic stress remain dormant. Additionally, we demonstrate that bactericidal antibiotics significantly upregulate proHJ transcription in the absence of externally imposed osmotic pressure, suggesting that the osmotically-controlled proline biosynthesis pathway is also involved in the antibiotic-mediated stress response
Identification of Differentially Expressed Genes during Bacillus subtilis Spore Outgrowth in High-Salinity Environments Using RNA Sequencing
In its natural habitat, the soil bacterium Bacillus subtilis often has to cope with fluctuating osmolality and nutrient availability. Upon nutrient depletion it can form dormant spores, which can revive to form vegetative cells when nutrients become available again. While the effects of salt stress on spore germination have been analyzed previously, detailed knowledge on the salt stress response during the subsequent outgrowth phase is lacking. In this study, we investigated the changes in gene expression during B. subtilis outgrowth in the presence of 1.2 M NaCl using RNA sequencing. In total, 402 different genes were upregulated and 632 genes were downregulated during 90 min of outgrowth in the presence of salt. The salt stress response of outgrowing spores largely resembled the osmospecific response of vegetative cells exposed to sustained high salinity and included strong upregulation of genes involved in osmoprotectant uptake and compatible solute synthesis. The ÏB-dependent general stress response typically triggered by salt shocks was not induced, whereas the ÏW regulon appears to play an important role for osmoadaptation of outgrowing spores. Furthermore, high salinity induced many changes in the membrane protein and transporter transcriptome. Overall, salt stress seemed to slow down the complex molecular reorganization processes (âripeningâ) of outgrowing spores by exerting detrimental effects on vegetative functions such as amino acid metabolism
Regulation of the Escherichia coli water channel gene aqpZ
Osmotic movement of water across bacterial cell membranes is postulated to be a homeostatic mechanism for maintaining cell turgor. The molecular water transporter remained elusive until discovery of the Escherichia coli water channel, AqpZ, however the regulation of the aqpZ gene expression and physiological function of the AqpZ protein are unknown. Northern analysis revealed a transcript of 0.7 kb, confirming the monocistronic nature of aqpZ. Regulatory studies performed with an aqpZ::lacZ low copy plasmid demonstrate enhanced expression during mid-logarithmic growth, and expression of the gene is dependent upon the extracellular osmolality, which increased in hypoosmotic environments but strongly reduced in hyperosmolar NaCl or KCl. While disruption of the chromosomal aqpZ is not lethal for E. coli, the colonies of the aqpZ knockout mutant are smaller than those of the parental wild-type strain. When cocultured with parental wild-type E. coli, the aqpZ knockout mutant exhibits markedly reduced colony formation when grown at 39 degrees C. Similarly, the aqpZ knockout mutant also exhibits greatly reduced colony formation when grown at low osmolality, but this phenotype is reversed by overexpression of AqpZ protein. These results implicate AqpZ as a participant in the adaptive response of E. coli to hypoosmotic environments and indicate a requirement for AqpZ by rapidly growing cells
The â„-Aminobutyrate Permease GabP Serves as the Third Proline Transporter of Bacillus subtilis
b PutP and OpuE serve as proline transporters when this imino acid is used by Bacillus subtilis as a nutrient or as an osmostress protectant, respectively. The simultaneous inactivation of the PutP and OpuE systems still allows the utilization of proline as a nutrient. This growth phenotype pointed to the presence of a third proline transport system in B. subtilis. We took advantage of the sensitivity of a putP opuE double mutant to the toxic proline analog 3,4-dehydro-DL-proline (DHP) to identify this additional proline uptake system. DHP-resistant mutants were selected and found to be defective in the use of proline as a nutrient. Whole-genome resequencing of one of these strains provided the lead that the inactivation of the â„-aminobutyrate (GABA) transporter GabP was responsible for these phenotypes. DNA sequencing of the gabP gene in 14 additionally analyzed DHPresistant strains confirmed this finding. Consistently, each of the DHP-resistant mutants was defective not only in the use of proline as a nutrient but also in the use of GABA as a nitrogen source. The same phenotype resulted from the targeted deletion of the gabP gene in a putP opuE mutant strain. Hence, the GabP carrier not only serves as an uptake system for GABA but also functions as the third proline transporter of B. subtilis. Uptake studies with radiolabeled GABA and proline confirmed this conclusion and provided information on the kinetic parameters of the GabP carrier for both of these substrates
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