Chromosome dynamics in Bacillus subtilis -Characterization of the Structural Maintenance of Chromosomes (SMC) complex

Alle Zellen müssen ihr Erbmaterial verdoppeln und dafür Sorge tragen, daß jede Tochterzelle einen kompletten Satz des Erbguts vor der Zellteilung erhält. In Bakterien müssen die Chromosomen organisiert und kompaktiert werden, während sie gleichzeitig dynamisch sein müssen, um laufende zelluläre Prozesse wie DNA Reparatur, Rekombination, Transktiption und Replikation zu ermöglichen. SMC (Structural Maintenance of Chromosome) Proteine bilden eine ubiquitäre Proteinfamilie, die eine zentrale Rolle in verschiedenen Chromosomendynamiken spielt. Das Hauptaugenmerk in dieser Arbeit ruht auf der Charakterisierung der SMC Proteine und ihrer Partner aus Bacillus subtilis. Genbanksuchen haben zu der Identifizierung zweier Interaktionspartner des SMC Proteins geführt. Diese Proteine, ScpA und ScpB, sind in Bakterien und Archaen konserviert. Die Deletion des scpA oder des scpB Gens führte zu einem der smc Deletionsmutante ähnlichen Phänotyp, d.h. temperatursensitivem langsamen Wachstum (unterhalb 23°C), dekondensierten Nukleoiden (zelluläre Struktur der Chromosomen) und einem ausgeprägten Segregationsdefekt. Die gleichzeitige Deletion der Gene erzeugte keinen veränderten Phänotyp, was zeigt, dass alle drei Proteine im gleichen Aspekt der Chromosomen-Kondensation und Segregation fungieren. Um ihre Funktion in vivo zu untersuchen, wurden die Proteine in Zellen mit Hilfe von voll funktionellen GFP Fusionen lokalisiert. Alle drei Proteine bildeten diskrete Foci in den Zellen, einem bis dato unbekannten Lokalisationsmuster, das sich dynamisch während des Zellzyklus veränderte: zu Beginn des Zellzyklus befanden sich die Foci in der Zellmitte, und nach der Verdopplung des Focus wanderten die beiden Foci rasch entgegengesetzt in Richtung der Zellpole. In diesen bipolaren Foci verblieben die drei Proteine für den Rest des Zellzyklus. Die Bildung des Proteinkomplexes konnte durch Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET) und durch Depletionsstudien belegt werden. So konnte die Bildung der Foci nur in Anwesenheit aller Proteine beobachtet werden, nicht jedoch in Abwesenheit eines der drei Proteine. Die spezifische Lokalisierung des SMC Komplex hing auch von fortlaufender DNA Replikation ab, von zellulärer Gyrase Aktivität (d.h. von der Struktur der DNA), sowie von der ATPase-Aktivität von SMC. Die Überproduktion von SMC führte zu einer Über-Kondensation der Nukleoide, wobei die Lokalisation des SMC Komplexes erhalten blieb, was darauf hin deutet, daß die beobachteten Foci aktive Kondensationszentren darstellen. Weiterhin zeigten die Proteine des SMC Komplex wachstumsabhängige Expression. SMC und ScpB waren nur in wachsenden Zellen vorhanden, und wurden rasch beim Übergang in die Statonärphase abgebaut. Die Analyse der RNA Mengen in verschiedenen Wachstumsphasen durch Primer Extensionsanalyse zeigte, daß das smc Transkript im Übergang zur Stationärphase nicht abnimmt. Diese Experimente zeigten einen bisher nicht identifizierten smc Promotor auf, und erbrachten den Nachweis, daß SMC posttranskriptionell reguliert wird. Die smc, scpA, und scpB Deletionsmutanten wiesen ebenfalls eine ausgeprägte Sensitivität gegenüber Mitomycin C (MMC) auf, welches Doppelstrangbrüche (DSBs) in die DNA einführt. Demnach wird der SMC Komplex ebenfalls für die Reparatur von DSBs benötigt. Weiterhin wurde die Funktion des SMC Proteins YirY untersucht, welches homolog zum DNA Reparatur Protein SbcC aus Escherichia coli ist. Die yirY Deletion führte ebenfalls zu einer deutlichen Sensitivität zu MMC, was eine Rolle in der DSB Reparatur belegt. In MMC behandelten Zellen bildete YirY Foci auf der DNA, welche aktive DSB Reparaturzentren darstellen könnten. In Gegensatz dazu waren die anderen Proteine aus dem gleichen Operon, AddA, AddB, and SbcD überall in den Zellen vorhanden und bildeten keine speziellen Strukturen, was darauf hindeutet, daß SbcC und AddAB in verschiedenen Reparaturwegen fungieren. Die subzelluläre Lokalisation der Topoisomerase IV Untereinheiten ParC und ParE wurde ebenfalls in dieser Arbeit beleuchtet. ParC lokalisierte auf dem gesamten Nukleoid, ganz im Gegenteil zu einer früheren Studie, in der ParC ausschließlich in der Nähe der Zellpole vorhanden war, wonach ParC eine spezialisierte Rolle bei der Dekatenierung von Chromosomen zugesprochen wurde. Durch Überproduktion von ParC und ParE wurden die Nukeloide noch stärker kompaktiert, was zusammen mit der Lokalisierung eine generelle Rolle in der Chromosomenkompaktierung belegt. Insgesamt läßt sich schlußfolgern, daß die Lokalisation von Proteinen, die an der Chromosomensegregation, DNA Reparatur und Translation beteiligt sind, ein wesendlich definierteres Bild der räumlichen Funktion der Proteine in lebenden Bakterien erbrachte

Untersuchungen zur generellen Stressantwort von Bacillus subtilis nach Einwirkung von Umweltstress und bei niedriger Temperatur

Zusammenfassung Der alternative Sigmafaktor SigB kontrolliert die Expression des generellen Stressregulons in Bacillus subtilis. Durch die Synthese von generellen Stressproteinen werden nicht-wachsende B. subtilis-Zellen mit einer unspezifischen, vielfältigen und vorsorgenden Resistenz gegen zukünftigen Stress ausgestattet. Um die Funktion der generellen Stressantwort im Adaptationsnetzwerk dieses Gram-positiven Modellorganismus besser zu verstehen, wurden die Veränderungen im Transkriptom nach Einwirkung von Hitze, Salz und Ethanolstress analysiert. Diese Studie wurde mit DNA-Makroarrays durchgeführt, auf die PCR-Produkte aller 4107 Gene gespottet waren. Insgesamt konnten 124 SigB-abhängige Gene identifiziert werden. Darunter wurden 62 Gene neu dem SigB-Regulon zugeordnet und 62 schon zuvor beschriebene SigB-abhängige Gene bestätigt. Die genomweite Betrachtung des Transkriptionsprofils nach Umweltstress erlaubte auch eine Analyse der spezifischen Stressantworten von B. subtilis auf Hitze-, Salz- und Ethanolstress. Neu war die Induktion des ECF-Sigmafaktors SigW und seines Regulons nach 4% Salzstress. In ?dot blot?-Experimenten konnte gezeigt werden, dass die Induktion des SigW-Regulons osmotisch bedingt war. Außerdem wurde die Induktion der generellen Stressantwort bei niedriger Temperatur untersucht. Mit SigB-abhängigen LacZ- und GFP-Reporterfusionen konnte der Induktionsverlauf des SigB-Regulons in der Kälte beobachtet werden. Bei 37 °C wird das SigB-Regulon nach Umweltstress sofort, aber transient induziert. In der Kälte war dagegen eine langanhaltende Induktion der ctc::lacZ-Reporterfusion in der exponentiellen Phase zu sehen. Nach einem Maximum in der exponentiellen Wachstumsphase fiel die Induktion bis zum Übergang in die stationäre Phase langsam wieder ab, um dann auf einem erhöhten Level zu stagnieren. Die Analyse verschiedener Regulatormutanten der SigB-Aktivität bestätigte den temperatursensitiven Phänotyp einer sigB-Mutante und dokumentierte die Wachstumsdefekte einer rsbP-Mutante und einer rsbUP-Mutante bei 15 °C, die vermutlich durch die schwache Induktion des SigB-Regulons in diesen Zellen verursacht waren. So stellte eine zusätzliche Deletion des Gens für den Anti-Antisigmafaktor RsbV in der rsbUP-Mutante die volle Induktion der Reporterfusion wieder her, wodurch ebenfalls der Wachstumsdefekt aufgehoben wurde. Die intensive, langanhaltende Induktion des generellen Stressregulons in der rsbUPV-Tripelmutante unterstützt die These eines neuen Signaltransduktionsweges zur Aktivierung von SigB in der Kälte. In weiteren Arbeiten wird zu klären sein, ob in die Aktivierung von SigB in der Kälte weitere Proteine einbezogen sind oder für die Aktivierung eine intrinsische Instabilität des RsbW/SigB-Komplexes verantwortlich ist

Charakterisierung der molekularen Determinanten zur hochaffinen Bindung der kompatiblen Soluten Glycin Betain, Prolin Betain, Ectoin und Hydroxyectoin durch Substratbindeproteine von bakteriellen ABC-Transportern

Die Akkumulation von kompatiblen Soluten ist ein weit verbreiteter Schutzmechanismus gegen variierende Umweltbedingungen und wird in vielen Spezies der Bacteria und Archaea verwendet. Das einige kompatible Solute nicht nur osmoprotektive Wirkung haben, sondern generell Protein-stabilisierende Substanzen sind, ist durch in vitro Experimente belegt. Der Protein-stabilisierende Effekt wird in dem „preferential exclusion model“ beschrieben und beruht auf dem thermodynamisch begründeten, bevorzugten Ausschluß der Solute von der Oberfläche der Proteine. In der vorliegenden Arbeit wurden die Substratbindeproteine zweier hochaffiner ABC-Transporter für die kompatiblen Solute Glycin Betain und Prolin Betain auf molekularer Ebene untersucht, um die Grundlagen zur Bindung von „bevorzugt ausgeschlossenen Soluten“ zu beschreiben. Dazu wurden die beiden hochaufgelösten Kristallstrukturen der Substratbindeproteine aus dem ProU-System von E. coli (EcProX, 1,6 Å) und dem ProU-System von A. fulgidus (AfProX 1,9 Å) verwendet. In EcProX wird das quartäre Amin des gebundenen Glycin Betains durch eine Box von drei Tryptophanen koordiniert (Trp-65, Trp-140 und Trp-188), die Carboxylgruppe des Glycin Betains wird durch H-Brücken stabilisiert. In einer Mutagenestudie konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Kation-pi-Interaktionen eine Haupt-Determinante in der Bindung von Glycin Betain sind. Es konnte gezeigt werden, dass neben Tryptophan auch Phenylalanin und Tyrosin zu starken Interaktionen mit dem Substrat fähig sind. Die Mutagenesestudie demonstrierte eine unterschiedlich starke Beteiligung der Tryptophane an der Substratbindung. Trp-188 ist dabei essentiell für die Bindung von Glycin Betain, Trp-140 zeigte die geringste Beteiligung. Trp-188 benötigt die Tryptophane Trp-140 und Trp-65 aber zur Stabilisierung des quartären Amins von Glycin Betain in der Bindetasche. Das AfProX Protein zeigt in Affinitätsmessungen eine besonders hohe Affinität zu Glycin Betain und Prolin Betain. Verglichen mit dem EcProX Protein ist die KD von AfProX zu Glycin Betain bei 50°C (0,01 µM) um den Faktor 100 niedriger als die des EcProX Proteins bei Raumtemperatur (KD=1µM) und um den Faktor 1000 niedriger verglichen zum OpuAC Protein (KD=17 µM), einem Glycin Betain und Prolin Betain bindenden Protein aus B. subtilis. In der Kristallstruktur von AfProX zeigte sich eine weitere Konstellation einer aromatischen Bindetasche. Das quartäre Amin wird dort von den vier Tyrosinen Tyr-63, Tyr-111, Tyr-190 und Tyr-214 (Tyrosin-Gürtel) und einem Aspartat koordiniert, die Carboxylgruppe wird durch Salz- und H-Brücken stabilisiert. Eine Mutagenesestudie zeigte auch hier die wichtige Beteiligung von Kation-pi-Interaktionen an der hochaffinen Bindung dieser kompatiblen Solute. Dabei ist die besondere Architektur des Tyrosin-Gürtels, zusammen mit den Carboxylgruppen-stabilisierenden Aminosäuren, essentiell für die hohe Bindeaffinität. Je nach Position des Tyrosins kann der Austausch eines Tyrosins gegen ein Alanin das Absinken der Bindekonstante auf einen Wert, vergleichbar zu dem des EcProX- oder des BsOpuAC-Proteins, oder niedriger bewirken. Ein Austausch von zwei Tyrosinen gegen Alanin bedeutet immer einen kompletten Verlust der Bindeaffinität. Datenbankanalysen der Aminosäuresequenzen von EcProX, AfProX und BsOpuAC zeigten eine weite Verbreitung der konservierten Bindemotive der Proteine und im Falle von BsOpuAC eine besonders starke Konservierung der bindungsrelevanen Tryptophane („Trp-Prisma“) sowie einen Domänentausch im Vergleich zu anderen Glycin Betain Bindeproteinen. Die Entdeckung eines Substratbindeprotein-abhängigen ABC-Transporters (Ehu) für Ectoin und Hydroxyectoin in S. meliloti erlaubte die Analyse der Ectoin-Bindung durch ein Substratbindeprotein. Nach der Überproduktion, Reinigung und Charakterisierung des hochaffinen Ectoin-Bindeproteins (EhuB) und dessen Kristallistation mit gebundenem Ectoin (und Hydroxyectoin) zeigte die Struktur (Auflösung 2,1 Å) in der Substratbindestelle eine aromatische Box aus zwei Phenylalaninen und einem Tyrosin, welche die delokalisierte positive Ladung des Moleküls binden. Der Pyrimidinring und die Carboxylgruppe des Ectoins werden durch Salz- und H-Brücken stabilisiert. Kation-pi-Interaktionen sind eine Hauptdeterminate in der hochaffinen Bindung von Glycin Betain und Prolin Betain, aber auch von Ectoin und Hydroxyectoin und finden eine weite Verbreitung in den Bacteria und Archaea

The GbsR Family of Transcriptional Regulators: Functional Characterization of the OpuAR Repressor

Accumulation of compatible solutes is a common stress response of microorganisms challenged by high osmolarity; it can be achieved either through synthesis or import. These processes have been intensively studied in Bacillus subtilis, where systems for the production of the compatible solutes proline and glycine betaine have been identified, and in which five transporters for osmostress protectants (Opu) have been characterized. Glycine betaine synthesis relies on the import of choline via the substrate-restricted OpuB system and the promiscuous OpuC transporter and its subsequent oxidation by the GbsAB enzymes. Transcription of the opuB and gbsAB operons is under control of the MarR-type regulator GbsR, which acts as an intracellular choline-responsive repressor. Modeling studies using the X-ray structure of the Mj223 protein from Methanocaldococcus jannaschii as the template suggest that GbsR is a homo-dimer with an N-terminal DNA-reading head and C-terminal dimerization domain; a flexible linker connects these two domains. In the vicinity of the linker region, an aromatic cage is predicted as the inducer-binding site, whose envisioned architecture resembles that present in choline and glycine betaine substrate-binding proteins of ABC transporters. We used bioinformatics to assess the phylogenomics of GbsR-type proteins and found that they are widely distributed among Bacteria and Archaea. Alignments of GbsR proteins and analysis of the genetic context of the corresponding structural genes allowed their assignment into four sub-groups. In one of these sub-groups of GbsR-type proteins, gbsR-type genes are associated either with OpuA-, OpuB-, or OpuC-type osmostress protectants uptake systems. We focus here on GbsR-type proteins, named OpuAR by us, that control the expression of opuA-type gene clusters. Using such a system from the marine bacterium Bacillus infantis, we show that OpuAR acts as a repressor of opuA transcription, where several compatible solutes (e.g., choline, glycine betaine, proline betaine) serve as its inducers. Site-directed mutagenesis studies allowed a rational improvement of the putative inducer-binding site in OpuAR with respect to the affinity of choline and glycine betaine binding. Collectively, our data characterize GbsR-/OpuAR-type proteins as an extended sub-group within the MarR-superfamily of transcriptional regulators and identify a novel type of substrate-inducible import system for osmostress protectants

Microseeding – A Powerful Tool for Crystallizing Proteins Complexed with Hydrolyzable Substrates

Hydrolysis is an often-encountered obstacle in the crystallization of proteins complexed with their substrates. As the duration of the crystallization process, from nucleation to the growth of the crystal to its final size, commonly requires several weeks, non-enzymatic hydrolysis of an “unstable” ligand occurs frequently. In cases where the crystallization conditions exhibit non neutral pH values this hydrolysis phenomenon may be even more pronounced. ChoX, the substrate binding protein of a choline ABC-importer, produced crystals with its substrate acetylcholine after one month. However, these crystals exhibited only choline, an acetylcholine hydrolysis product, in the binding site. To overcome this obstacle we devised a microseeding protocol leading to crystals of ChoX with bound acetylcholine within 24 hours. One drawback we encountered was the high twinning fraction of the crystals, possibly was due to the rapid crystal growth

Compatible Solute Synthesis and Import by the Moderate Halophile Spiribacter salinus: Physiology and Genomics

Members of the genus Spiribacter are found worldwide and are abundant in ecosystems possessing intermediate salinities between seawater and saturated salt concentrations. Spiribacter salinus M19-40 is the type species of this genus and its first cultivated representative. In the habitats of S. salinus M19-40, high salinity is a key determinant for growth and we therefore focused on the cellular adjustment strategy to this persistent environmental challenge. We coupled these experimental studies to the in silico mining of the genome sequence of this moderate halophile with respect to systems allowing this bacterium to control its potassium and sodium pools, and its ability to import and synthesize compatible solutes. S. salinus M19-40 produces enhanced levels of the compatible solute ectoine, both under optimal and growth-challenging salt concentrations, but the genes encoding the corresponding biosynthetic enzymes are not organized in a canonical ectABC operon. Instead, they are scrambled (ectAC; ectB) and are physically separated from each other on the S. salinus M19-40 genome. Genomes of many phylogenetically related bacteria also exhibit a non-canonical organization of the ect genes. S. salinus M19-40 also synthesizes trehalose, but this compatible solute seems to make only a minor contribution to the cytoplasmic solute pool under osmotic stress conditions. However, its cellular levels increase substantially in stationary phase cells grown under optimal salt concentrations. In silico genome mining revealed that S. salinus M19-40 possesses different types of uptake systems for compatible solutes. Among the set of compatible solutes tested in an osmostress protection growth assay, glycine betaine and arsenobetaine were the most effective. Transport studies with radiolabeled glycine betaine showed that S. salinus M19-40 increases the pool size of this osmolyte in a fashion that is sensitively tied to the prevalent salinity of the growth medium. It was amassed in salt-stressed cells in unmodified form and suppressed the synthesis of ectoine. In conclusion, the data presented here allow us to derive a genome-scale picture of the cellular adjustment strategy of a species that represents an environmentally abundant group of ecophysiologically important halophilic microorganisms.España Ministerio de Economía y Competitividad CGL2013-46941-P and CGL2017-83385-

Stress-induced activation of the proline biosynthetic pathway in Bacillus subtilis:A population-wide and single-cell study of the osmotically controlled proHJ promoter

Bacillus subtilis, in its natural habitat, is regularly exposed to rapid changes in the osmolarity of its surrounding. As its primary survival strategy, it accumulates large amounts of the compatible solute proline by activating the de novo proline biosynthesis pathway and exploiting the glutamate pools. This osmotically-induced biosynthesis requires activation of a SigA-type promoter that drives the expression of the proHJ operon. Population-wide studies have shown that the activity of the proHJ promoter correlates with the increased osmotic pressure of the environment. Therefore, the activation of the proHJ transcription should be an adequate measure of the adaptation to osmotic stress through proline synthesis in the absence of other osmoprotectants. In this study, we investigate the kinetics of the proHJ promoter activation and the early adaptation to mild osmotic upshift at the single-cell level. Under these conditions, we observed a switching point and heterogeneous proline biosynthesis gene expression, where the subpopulation of cells showing active proHJ transcription is able to continuously divide, and those unresponsive to osmotic stress remain dormant. Additionally, we demonstrate that bactericidal antibiotics significantly upregulate proHJ transcription in the absence of externally imposed osmotic pressure, suggesting that the osmotically-controlled proline biosynthesis pathway is also involved in the antibiotic-mediated stress response

Identification of Differentially Expressed Genes during Bacillus subtilis Spore Outgrowth in High-Salinity Environments Using RNA Sequencing

In its natural habitat, the soil bacterium Bacillus subtilis often has to cope with fluctuating osmolality and nutrient availability. Upon nutrient depletion it can form dormant spores, which can revive to form vegetative cells when nutrients become available again. While the effects of salt stress on spore germination have been analyzed previously, detailed knowledge on the salt stress response during the subsequent outgrowth phase is lacking. In this study, we investigated the changes in gene expression during B. subtilis outgrowth in the presence of 1.2 M NaCl using RNA sequencing. In total, 402 different genes were upregulated and 632 genes were downregulated during 90 min of outgrowth in the presence of salt. The salt stress response of outgrowing spores largely resembled the osmospecific response of vegetative cells exposed to sustained high salinity and included strong upregulation of genes involved in osmoprotectant uptake and compatible solute synthesis. The σB-dependent general stress response typically triggered by salt shocks was not induced, whereas the σW regulon appears to play an important role for osmoadaptation of outgrowing spores. Furthermore, high salinity induced many changes in the membrane protein and transporter transcriptome. Overall, salt stress seemed to slow down the complex molecular reorganization processes (“ripening”) of outgrowing spores by exerting detrimental effects on vegetative functions such as amino acid metabolism

Regulation of the Escherichia coli water channel gene aqpZ

Osmotic movement of water across bacterial cell membranes is postulated to be a homeostatic mechanism for maintaining cell turgor. The molecular water transporter remained elusive until discovery of the Escherichia coli water channel, AqpZ, however the regulation of the aqpZ gene expression and physiological function of the AqpZ protein are unknown. Northern analysis revealed a transcript of 0.7 kb, confirming the monocistronic nature of aqpZ. Regulatory studies performed with an aqpZ::lacZ low copy plasmid demonstrate enhanced expression during mid-logarithmic growth, and expression of the gene is dependent upon the extracellular osmolality, which increased in hypoosmotic environments but strongly reduced in hyperosmolar NaCl or KCl. While disruption of the chromosomal aqpZ is not lethal for E. coli, the colonies of the aqpZ knockout mutant are smaller than those of the parental wild-type strain. When cocultured with parental wild-type E. coli, the aqpZ knockout mutant exhibits markedly reduced colony formation when grown at 39 degrees C. Similarly, the aqpZ knockout mutant also exhibits greatly reduced colony formation when grown at low osmolality, but this phenotype is reversed by overexpression of AqpZ protein. These results implicate AqpZ as a participant in the adaptive response of E. coli to hypoosmotic environments and indicate a requirement for AqpZ by rapidly growing cells

The ␥-Aminobutyrate Permease GabP Serves as the Third Proline Transporter of Bacillus subtilis

b PutP and OpuE serve as proline transporters when this imino acid is used by Bacillus subtilis as a nutrient or as an osmostress protectant, respectively. The simultaneous inactivation of the PutP and OpuE systems still allows the utilization of proline as a nutrient. This growth phenotype pointed to the presence of a third proline transport system in B. subtilis. We took advantage of the sensitivity of a putP opuE double mutant to the toxic proline analog 3,4-dehydro-DL-proline (DHP) to identify this additional proline uptake system. DHP-resistant mutants were selected and found to be defective in the use of proline as a nutrient. Whole-genome resequencing of one of these strains provided the lead that the inactivation of the ␥-aminobutyrate (GABA) transporter GabP was responsible for these phenotypes. DNA sequencing of the gabP gene in 14 additionally analyzed DHPresistant strains confirmed this finding. Consistently, each of the DHP-resistant mutants was defective not only in the use of proline as a nutrient but also in the use of GABA as a nitrogen source. The same phenotype resulted from the targeted deletion of the gabP gene in a putP opuE mutant strain. Hence, the GabP carrier not only serves as an uptake system for GABA but also functions as the third proline transporter of B. subtilis. Uptake studies with radiolabeled GABA and proline confirmed this conclusion and provided information on the kinetic parameters of the GabP carrier for both of these substrates