Studio del ruolo della serotonina durante lo sviluppo del sistema nervoso di Xenopus laevis

La serotonina ( 5-HT ) è un neurotrasmettitore che media una grande varietà di funzioni sia nel sistema nervoso centrale che nel sistema nervoso periferico adulto. Negli ultimi anni si è andata affermando l’idea che la serotonina, durante lo sviluppo embrionale, possa funzionare come segnale di regolazione in processi di neurogenesi, controllo della proliferazione e sinaptogenesi, aiutando a scolpire finemente l’architettura finale del sistema nervoso. Per studiare il ruolo della serotonina durante lo sviluppo embrionale abbiamo scelto come modello sperimentale Xenopus laevis. Come studio preliminare ho caratterizzato la presenza spazio-temporale della serotonina nel sistema nervoso di Xenopus, durante lo sviluppo, effettuando esperimenti di immunoistochimica con un anticorpo specifico contro-5HT. Questa analisi ha messo in evidenza che la serotonina è presente nei nuclei rombencefalici del raphe a partire da stadio 35 e rimane presente in queste cellule durante tutte le fasi successive dello sviluppo e nel cervello adulto. La serotonina risulta inoltre presente durante lo sviluppo in cellule amacrine dell’occhio e in cellule dell’epidermide. Sia nella vita adulta che durante lo sviluppo le molteplici attività della serotonina sono mediate da recettori accoppiati a proteine G che hanno un’ampia distribuzione nel sistema nervoso centrale. Nel nostro laboratorio è stato dimostrato che l’RNA messaggero per il recettore 5-HT2B è espresso, durante lo sviluppo di Xenopus, in regioni proliferative della retina e del sistema nervoso centrale. Nel mio lavoro di tesi mi sono occupata dello studio del ruolo del recettore 5-HT2B durante lo sviluppo, effettuando esperimenti di perdita di funzione mediante la microiniezione, negli embrioni a due o quattro cellule, di un oligonucleotide antisenso modificato (morpholino) complementare alla regione a valle del primo codone dell’mRNA di X5-HT2B, ed esperimenti di guadagno di funzione mediante la microiniezione di mRNA codificante per X5-HT2B. Inoltre, per essere sicura che il recettore ectopico venisse attivato, ho somministrato 5-HT agli embrioni iniettati. Allo scopo di mettere in evidenza eventuali variazioni di struttura, proliferazione e morte cellulare legate alla modulazione di questo recettore, le sezioni di questi embrioni a stadio 42, sono state analizzate mediante: immunoistochimica con anticorpi contro N-tubulina e fosfoistone H3, ibridazione in situ per ciclina D1, tunel “assay”, colorazione hoechst. Dall’analisi complessiva di questi esperimenti ho messo in evidenza un ruolo importante, del recettore 5-HT2B nella morfogenesi dell’occhio attraverso la regolazione della proliferazione e della sopravvivenza cellulare. Inoltre gli studi di sovraespressione genica che ho condotto confermano che gli effetti proliferativi di questo recettore sono attivati dal suo legame con la serotonina. Parallelamente a questo studio funzionale mi sono occupata anche di caratterizzare, in Xenopus laevis, il profilo di espressione spazio-temporale di due geni implicati nell’omeostasi del sistema serotoninergico: il trasportatore serotoninergico (X5-HTT), che codifica per l’unica proteina in grado di effettuare il “re-uptake” della serotonina e la triptofano idrossilasi (XTph), enzima limitante della biosintesi della 5-HT. Per la caratterizzazione di XTph e X5-HTT , ho costruito due sonde a RNA antisenso marcate con digossigenina, con cui ho effettuato esperimenti di ibridazioni in situ, sia su sezioni che whole mount, di embrioni di Xenopus a vari stadi, sino all’adulto. Ciò mi ha permesso di riscontrare che l’mRNA di X5-HTT è espresso nei neuroni dei nuclei del raphe a partire da stadio 30 sino all’adulto, che ha un espressione transiente intorno a stadio 33 nella ghiandola pineale e che a stadio 45 è presente nello strato nucleare interno della retina. L’mRNA di XTph, invece, è espresso nella ghiandola pineale a partire da stadio 28, e a stadio 45 ne ho riscontrato la presenza anche nei fotorecettori della retina, nei nuclei ipotalamici ventrali, nella faringe e nell’intestino, rispecchiando il profilo di espressione dell’isoforma Tph1 nota nei mammiferi. I risultati ottenuti durante il mio lavoro di tesi descrivono per la prima volta l’espressione del trasportatore serotoninergico durante lo sviluppo di Xenopus e confermano un ruolo importante della serotonina nella morfogenesi del sistema nervoso, ed in particolare dell’occhio, mediati dall’attivazione del recettore serotoninergico 5-HT2B. Inoltre il profilo di espressione di XTph che ho ottenuto, mi consente di ipotizzare che anche in Xenopus, come in altri vertebrati esista una seconda isoforma di Tph che sintetizza serotonina nei nuclei del raphe

5-HT2B receptor mediates serotonin morphogenetic signaling during Xenopus laevis eye and craniofacial development

The monoamine serotonin (5-HT), is a well-known neurotransmitter that influences a wide variety of central and peripheral functions in the adult organism. Increasing experimental evidences demonstrated that 5-HT plays also an important role in morphogenesis by modulating processes such as gastrulation, craniofacial and bone patterning and the generation of the left-right asymmetry, as well as in neural development and plasticity. Among 5-HT receptors, 5-HT2B is expressed during CNS, heart and craniofacial development. By using Xenopus laevis as a model system, our research group previously demonstrated that 5-HT2B receptor is expressed in the proliferative region of the retina and the neural tube and that 5-HT2B loss of function results in abnormal eye morphology due to a decrease in the proliferation rate of retinoblasts and an increase of the apoptotic rate of retinal cells. In order to further investigate the role of 5-HT2B in eye development, during the first part of my PhD program, I performed complementary gene gain of function experiments. I found that 5-HT2B over-expression resulted in the formation of eyes with irregular form, position and orientation and showing defects in the optic fissure closure and in the pigmented epithelium formation. A detailed molecular analysis also revealed a disorganization of the typical laminar retinal structure and the presence of differentiated retinal cells in ectopic position. As mouse embryos treated with 5-HT2 antagonists develop severe craniofacial alterations, during the second part of my PhD program, I asked the question whether 5-HT2B receptor signaling could also play a role in craniofacial development. Gene gain and loss of function experiments revealed a direct involvement of 5-HT2B receptor in mediating 5-HT morphogenetic action during craniofacial skeletal development by influencing cranial neural crest cells development

5-HT2B-mediated serotonin signalling participates in retinal and craniofacial morphogenesis during Xenopus laevis development

Serotonin (5HT) is a neurotransmitter that mediates a wide variety of effects in the central and peripheral adult nervous system. Experimental evidences demonstrated that serotonin even has an important role as growth and differentiating factor for neuronal and non-neuronal cells by controlling proliferation, migration and apoptosis during development. All the biological actions of 5-HT are mediated by G-coupled receptors and, among these, the 5-HT2B receptor is expressed during CNS, heart and craniofacial development. By using Xenopus laevis as a model system, we demonstrated that 5HT2B receptor loss of function determines a decrease in the proliferation rate of retinoblasts and increases the apoptosis of retinal cells thus resulting in abnormal eye morphology (De Lucchini et al., 2005). In order to further investigate 5HT2B role during development, we performed complementary experiments of gene gain of function. The overexpression of 5HT2B, leads to the formation of eyes with irregular form, position and orientation and showing defects in the optic fissure closure and in the pigmented epithelium formation. A detailed molecular analysis pointed out a disorganization of the typical laminar retinal structure and the presence of differentiated neuronal cells in ectopic position. Moreover, as pharmacological treatments with 5HT2 antagonists elicited in mice craniofacial alterations, we are studying the formation of craniofacial muscles and skeletal elements in the overexpressing 5HT2B embryos. In particular, 5HT2B gene gain of function results in altered formation of extraocular muscles as well as of the jaw and hyoid cartilages and correlated muscles. Conclusion: We showed that 5HT, via 5HT2B receptor, is among the key extracellular signals that control Xenopus retinal histogenesis and eye morphogenesis. Moreover our results indicate for the first time a direct involvement 5-HT2B receptors in mediating the serotonin action on craniofacial morphogenesis by influencing the formation of skeletal elements and that of the connected muscles

Polycomb dysregulation in gliomagenesis targets a Zfp423-dependent differentiation network

Malignant gliomas constitute one of the most significant areas of unmet medical need, owing to the invariable failure of surgical eradication and their marked molecular heterogeneity. Accumulating evidence has revealed a critical contribution by the Polycomb axis of epigenetic repression. However, a coherent understanding of the regulatory networks affected by Polycomb during gliomagenesis is still lacking. Here we integrate transcriptomic and epigenomic analyses to define Polycomb-dependent networks that promote gliomagenesis, validating them both in two independent mouse models and in a large cohort of human samples. We find that Polycomb dysregulation in gliomagenesis affects transcriptional networks associated with invasiveness and de-differentiation. The dissection of these networks uncovers Zfp423 as a critical Polycomb-dependent transcription factor whose silencing negatively impacts survival. The anti-gliomagenic activity of Zfp423 requires interaction with the SMAD proteins within the BMP signalling pathway, pointing to a novel synergic circuit through which Polycomb inhibits BMP signalling