Development of novel targeted lentiviral vectors for gene therapy of motor neuron diseases

Motor Neuron Diseases (MND) including Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and Spinal Muscular Atrophy (SMA) are neurodegenerative diseases that can cause progressive paralysis and premature death, while there are no treatments available up to date. Gene therapy using lentiviruses has been successful at alleviating symptoms and extending survival in murine models of both. Restricting transduction to specific cells, is critical for safe and efficient gene therapy. The aim of this study was to generate novel lentiviral vectors with tropism to motor neurons (MNs) using surface engineering, that involves incorporation of a fusogenic glycoprotein (mutated sindbis G) and an antibody recognizing a cell-surface receptor, onto the lentiviral surface. Antibodies against rat Thy1.1, rat p75NTR (Low Affinity Nerve Growth Factor Receptor) and mouse CAR (Coxsackie and adenovirus receptor) receptors expressed on the presynaptic terminal of the neuromuscular junction (NMJ) were cloned and used to surface engineer high titer lentiviral vectors ( Thy1.1, p75NTR and CAR). These vectors preferentially transduced cell lines expressing these receptors and primary motor neuron cultures compared to non-targeted controls. The ability of these vectors to be transported retrogradely and transduce MNs was demonstrated in vitro in compartmented microfluidic cultures in fixed and live imaging experiments. Tropism of these vectors was assessed in vivo in the rat brain following intrastiatal injections. In vivo intramuscular delivery of CAR targeted lentiviral vectors in tibialis anterior of mice lead to transduction of motor neurons in ventral spinal cord. Transduction of spinal cord was further demonstrated by in vivo bioluminescence imaging studies in mice injected intramuscularly with the CAR targeted vectors. This is the first ever demonstration that surface engineering can confer novel trafficking and transduction characteristics to lentiviral vectors. These targeted lentiviral vectors have superior trafficking, transduction and specificity for MNs than previously used lentiviral vectors, making them good candidates for non-invasive CNS -targeted delivery of therapeutics in MN diseases.Open Acces

Evaluation of the performance of the methods used for the diagnosis of the peripheral arterial diasease in diabetes

Background and aims:Peripheral arterial disease (PAD) is a major risk factor in diabetic foot disease.Ankle-brachial index (ABI) and toe-brachial index (TBI) are the most commonscreening methods for detecting PAD in diabetic patients. However, concernspersist regarding their accuracy. The aim of the present study was to evaluatethe performance of various screening methods in patients with type 2 diabetes(T2DM) and to examine whether the presence of peripheral neuropathy (PN)and/or cardiac autonomic neuropathy (CAN) alters their performance for thediagnosis of PAD.Patients and methods:A total of 180 patients (360 feet) were studied, 100 patients with T2DM (meanage 66.5 ± 8.7 years) and 80 individuals without T2DM (mean age 62.5 ± 8.7years). Ankle pressures were measured with a hand-held Doppler device andtoe pressures by photoplethysmography at the great toe of both feet. ABI andTBI were calculated. Transcutaneous oxygen pressure (TcPO2) was measuredat the dorsum of both feet. Haemoglobin oxygen saturation (SpO2) wasmeasured by pulse oximetry at the index finger and on the great toe of bothfeet in supine position and at 30 cm elevation. ABI values 2% από τον μετρούμενο κορεσμότου δείκτη ή μείωση του κορεσμού κατά την ανύψωση των άκρων στα 30 cm>2% από τη μετρούμενη τιμή κορεσμού στην ύπτια θέση θεωρήθηκανπαθολογικές. Η διάγνωση της ΠΑ βασίστηκε στην παρουσία διφασικής,μονοφασικής ή επίπεδης κυματομορφής στην οπίσθια κνημιαία αρτηρία. Ηδιάγνωση της ΠΝ βασίστηκε στο δείκτη συμπτωμάτων, στο δείκτη ευρημάτωντης νευροπάθειας και στο ουδό αντίληψης των δονήσεων, ενώ της ΚΑΝ στις 4κλασσικές δοκιμασίες κατά Ewing.Αποτελέσματα:ΠΑ είχαν 41 ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη και 13 άτομα χωρίς σακχαρώδηδιαβήτη.Ο ABI ήταν η μέθοδος με τη μεγαλύτερη αξιοπιστία για τη διάγνωση της ΠΑστην παρούσα μελέτη. Ο TBI είχε λίγο χαμηλότερη ευαισθησία και ειδικότηταγια τη διάγνωση της ΠΑ σε σύγκριση με τον ΑΒΙ, ενώ η TcPO2 και ο SpO2 δενβρέθηκαν να είναι αξιόπιστες μέθοδοι για την ανίχνευση της ΠΑ. Η παρουσίαΠΝ ή ΚΑΝ δεν επηρέασε την αξιοπιστία του ΑΒΙ, ενώ η παρουσία της ΚΑΝμείωσε την ειδικότητα του ΤΒΙ. Συμπέρασμα:Η μέτρηση του ABI είναι η καλύτερη μέθοδος ανίχνευσης της ΠΑ σε ασθενείςμε ΣΔ2 αλλά και σε μη διαβητικά άτομα. Η παρουσία ΠΝ ή/και ΚΑΝ σεασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη δεν επηρεάζει την αξιοπιστία της μεθόδου

Evaluation of natural and synthetic efflux pump inhibitors on Pseudomonas aeruginosa strains

Multidrug resistant bacteria have become an extremely serious public health concern. Pseudomonas aeruginosa is a common cause of nosocomial infections and is classified as a priority pathogen by the World Health Organization due to its high resistance rate. Bacteria can develop resistance through various mechanisms. Drug extrusion by the multidrug efflux pumps represents an important mechanism of antimicrobial resistance. Inhibitors of bacterial efflux pumps as adjuvants in antibacterial therapy are a reasonable and cost-effective pursuit since the shortage of antibiotics threatens global human health. Combined use of synthetic or natural compounds with conventional antibiotics constitutes a promising alternative for fighting antibiotic resistance, as this could restore the activity of existing antibiotics. In the present study, the potential role of the natural compounds carvacrol and thymol and synthetic CuO, ZnO and CuZn nanoparticles as efflux pump inhibitors has been investigated against multidrug resistant strains of Pseudomonas aeruginosa. The mode of action of these compounds was evaluated by studying their synergistic activity in combination with the antibiotics meropenem, ciprofloxacin/levofloxacin and azithromycin at sub-inhibitory concentrations against efflux-pump over-expressed P. aeruginosa. The interaction of the combination was investigated by checkerboard microdilution method and time-kill curves. The compounds were further examined with real time fluorometry for the ethidium bromide (EtBr) uptake and efflux assay and membrane permeabilization. Also, their activity on the relative expression of mexA, mexB and mexC efflux pump genes and their ability to reduce the frequency of mutation was investigated. Their safety profile was evaluated in vitro by cytotoxicity (MTT, NR) and hemolysis assays. The results showed that both carvacrol, thymol and the tested nanoparticles act synergistically, in a concentration-dependent manner, with antibiotics known to be subject to efflux in P. aeruginosa reducing their MIC values. Furthermore, all the tested compounds at sub-inhibitory concentrations enhanced the intracellular accumulation of EtBr and reduced its efflux from the bacterial cells. The mechanism of their action can be explained by the reduction on the relative expression of the examined efflux pump genes. The antibiotic-EPIs combinations resulted in extended post-antibiotic effects. Furthermore, the natural inhibitors carvacrol and thymol reduced the frequency of mutant strains, and they did not display toxicity at concentrations needed to exert their activity. The synthetic nanoparticles showed toxicity except for the ZnO NPs which were biocompatible. These results suggest that both the natural compounds carvacrol, thymol and the synthetic nanoparticles may serve as potential sources of efflux pump inhibitors to tackle antimicrobial resistance.Τα πολυανθεκτικά βακτήρια αποτελούν μια εξαιρετικά σοβαρή απειλή για τη δημόσια υγεία. Το βακτήριο Pseudomonas aeruginosa αποτελεί συχνή αιτία ενδονοσοκομειακών λοιμώξεων και έχει ταξινομηθεί από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας ως επικίνδυνο παθογόνο εξαιτίας των υψηλών ποσοστών αντοχής που εμφανίζει. Τα βακτήρια μπορούν να αναπτύξουν αντοχή μέσω διαφόρων μηχανισμών. Η αποβολή φαρμάκων από τις αντλίες ενεργητικής εκροής αποτελεί έναν σημαντικό μηχανισμό μικροβιακής αντοχής. Οι αναστολείς αντλιών εκροής ως ενισχυτικά της υπάρχουσας αντιμικροβιακής θεραπείας είναι μια λογική και αποδοτική προσέγγιση, καθώς η έλλειψη νέων αντιβιοτικών απειλεί την παγκόσμια υγεία. Η συνδυαστική χορήγηση φυσικών ή συνθετικών ενώσεων μαζί με συμβατικά αντιβιοτικά αποτελεί μια πολλά υποσχόμενη εναλλακτική θεραπευτική λύση καθώς θα μπορούσε να επαναφέρει τη δράση αντιβιοτικών που δεν χρησιμοποιούνται λόγω αναποτελεσματικότητας. Στην παρούσα διατριβή, διερευνήθηκε ο ρόλος των φυσικών ενώσεων καρβακρόλη και θυμόλη και των συνθετικών νανοσωματιδίων CuO@PEG, ZnO@PEG και CuZn@TrEG ως αναστολείς των αντλιών εκροής σε πολυανθεκτικά στελέχη P. aeruginosa. Ο τρόπος δράσης τους αξιολογήθηκε με τη διερεύνηση της συνεργιστικής τους αλληλεπίδρασης σε συνδυασμό με τα αντιβιοτικά μεροπενέμη, σιπροφλοξασίνη/λεβοφλοξασίνη και αζιθρομυκίνη σε υπο-ανασταλτικές συγκεντρώσεις σε βακτηριακά στελέχη P. aeruginosa με ενεργό σύστημα εκροής. Η μεταξύ τους αλληλεπίδραση αξιολογήθηκε με τη μέθοδο checkerboard και τις καμπύλες κυτταρικού θανάτου. Οι φυσικές και συνθετικές ενώσεις διερευνήθηκαν με χρήση φθορισμόμετρου ως προς την ικανότητα να αναστέλλουν την εκροή της χρωστικής βρωμιούχου αιθιδίου (EtBr) και να προωθούν την ενδοκυτταρική της συγκέντρωση. Επίσης εξετάστηκε ο ρόλος τους στη βακτηριακή μεμβράνη, στη σχετική έκφραση των γονιδίων mexA, mexB και mexC των αντλιών εκροής MexAB-OprM και MexCD-OprJ αλλά και στην ικανότητα ταχείας ανάπτυξης αντοχής. Η ασφάλεια τους διερευνήθηκε in vitro με αναλύσεις τοξικότητας (MTT, NR) και τη δοκιμασία αιμόλυσης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η καρβακρόλη και η θυμόλη αλλά και τα εξεταζόμενα νανοσωματίδια έχουν συνεργιστική δράση με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, με αντιβιοτικά που υπόκεινται σε εκροή μειώνοντας τις τιμές MIC τους. Επιπλέον, όλες οι εξεταζόμενες ενώσεις σε υπο-ανασταλτική συγκέντρωση ενίσχυσαν την ενδοκυτταρική συσσώρευση του EtBr και μείωσαν την εκροή του από τα βακτηριακά κύτταρα. Ο μηχανισμός της δράσης τους μπορεί να εξηγηθεί από τη μείωση που παρατηρήθηκε στη σχετική έκφραση των εξεταζόμενων γονιδίων των αντλιών εκροής. Η συγχορήγηση των υποψήφιων αναστολέων με τις κινολόνες και την αζιθρομυκίνη είχε ως αποτέλεσμα παρατεταμένη μετα-αντιβιοτική δράση. Επιπλέον, οι φυσικοί αναστολείς καρβακρόλη και θυμόλη μείωσαν σημαντικά τη συχνότητα εμφάνισης ανθεκτικών μεταλλαγμάτων ενώ δεν παρουσίασαν τοξικότητα στις συγκεντρώσεις που απαιτούνται για να ασκήσουν τη δράση τους. Τα νανοσωματίδια εμφάνισαν τοξική δράση εκτός από τα νανοσωματίδια ZnO που ήταν πλήρως βιοσυμβατά. Τα παραπάνω αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι τόσο οι φυσικές ενώσεις καρβακρόλη και θυμόλη όσο και τα συνθετικά νανοσωματίδια μπορούν να αποτελέσουν πηγή αναστολέων αντλιών εκροής για την αντιμετώπιση της μικροβιακής αντοχής

Screening for the High-risk Foot of Ulceration: Tests of Somatic and Autonomic Nerve Function

Diabetic foot ulcers affect almost 5% of the patients with diabetes and carry a huge physical, emotional, and financial burden. Almost 80% of amputations in patients with diabetes are preceded by a foot ulcer. The need for simple screening methods for prevention of foot ulcers and amputations is indisputable. Simple tests such as monofilament, tuning fork, vibration perception threshold determination, ankle reflexes, and pinprick sensation alone or in combination have been studied prospectively and can be used for identification of patients at risk. Newer tests examining sudomotor dysfunction and skin dryness have been introduced in recent years. In cross-sectional studies sudomotor dysfunction assessed by either sympathetic skin response or NEUROPAD (TM) (Miro Verbandstoffe GmbH, Wiehl-Drabenderhohe, Germany) testing has been consistently associated with foot ulceration. In addition, NEUROPAD (TM) testing is simple, reproducible, and widely available and has a high sensitivity for the diagnosis of clinical or subclinical diabetic polyneuropathy. Prospective studies are required to establish whether sudomotor dysfunction can predict foot ulcers and if simple methods assessing sudomotor dysfunction (eg, NEUROPAD (TM) testing) can be included in the screening tests for the prevention of this complication

SGLT2 Inhibitors: A Review of Their Antidiabetic and Cardioprotective Effects

Type 2 diabetes mellitus is a chronic metabolic disease associated with high cardiovascular (CV) risk. Sodium-glucose co-transporter 2 inhibitors (SGLT2i) are the latest class of antidiabetic medication that inhibit the absorption of glucose from the proximal tubule of the kidney and hence cause glycosuria. Four SGLT2i are currently commercially available in many countries: canagliflozin, dapagliflozin, empagliflozin, and ertugliflozin. SGLT2i reduce glycated hemoglobin by 0.5%–1.0% and have shown favorable effects on body weight, blood pressure, lipid profile, arterial stiffness and endothelial function. More importantly, SGLT2i have demonstrated impressive cardioprotective and renoprotective effects. The main mechanisms underlying their cardioprotective effects have been attributed to improvement in cardiac cell metabolism, improvement in ventricular loading conditions, inhibition of the Na+/H+ exchange in the myocardial cells, alteration in adipokines and cytokines production, as well as reduction of cardiac cells necrosis and cardiac fibrosis. The main adverse events of SGLT2i include urinary tract and genital infections, as well as euglycemic diabetic ketoacidosis. Concerns have also been raised about the association of SGLT2i with lower limb amputations, Fournier gangrene, risk of bone fractures, female breast cancer, male bladder cancer, orthostatic hypotension, and acute kidney injury

Immunogenicity of SARS-CoV-2 BNT162b2 Vaccine in People with Diabetes: A Prospective Observational Study

The mRNA-based BNT162b2 vaccine has demonstrated high efficacy against severe SARS-CoV-2. However, data regarding immune response in people with diabetes mellitus (DM) after vaccination with the BNT162b2 vaccine are limited. In this prospective observational study, we examined humoral immune response in participants with and without DM after vaccination with the BNT162b2 mRNA vaccine. A total of 174 participants (58 with and 116 without diabetes, matched for age) were included. Antibodies were measured 21 days after the first dose, 7–15 days after the second dose, and 70–75 days after the second and before the third dose of the vaccine. Antibodies were measured by an anti-SARS-CoV-2 receptor-binding domain IgG (Abs-RBD-IgG) assay by a chemiluminescent microparticle immune assay; values > 50 AU/mL are considered protective from severe disease. Almost 17% of participants with DM did not develop adequate humoral immune response to the BNT162b2 mRNA vaccine after the first dose; however, it was high and similar after the second dose in both participants with and without DM and remained so almost 2 months after the second dose of the vaccine. Geometric mean values of Abs-RBD-IgG were not significantly different between participants with and without DM during the study. At least two doses of the BNT162b2 vaccine are necessary to ensure adequate and sustainable immune response in people with DM