Ivermectin resistance in the bovine nematode Cooperia oncophora

Wereldwijd zorgen gastro-intestinale (GI) worminfecties voor belangrijke productieverliezen in de veeteelt. De meest voorkomende GI nematoden bij rundvee in streken met een gematigd klimaat zijn de lebmaagnematode Ostertagia ostertagi en de dunnedarm-nematode Cooperia oncophora. Controle van deze nematoden bij runderen steunt voornamelijk op het gebruik van drie klassen breedspectrum anthelminthica: de benzimidazoles (BZs), levamisole en de macrocyclische lactones (MLs). Het intensieve gebruik van deze anthelminthica heeft ertoe geleid dat anthelminthicum resistentie zich heeft ontwikkeld in deze economisch belangrijke GI nematoden. In dit proefschrift onderzoeken we in eerste instantie de situatie van ML resistentie in Belgische en Duitse veehouderijen en de daaraan gebonden risico en confounding factoren. Verder hebben we in enkele bedrijven, waar ML resistentie bij C. oncophora vastgesteld werd, deze isolaten verzameld. In deze isolaten is gezocht naar genetische veranderingen in twee genen, GluCl en β tubuline, waarvan vermoed werd dat ze betrokken zijn bij ML resistentie in C. oncophora. Moleculaire veranderingen zouden kunnen gebruikt worden als merker in gevoelige diagnostische testen, die het beheer van GI nematoden aanzienlijk kunnen verbeteren. De doeltreffendheid van MLs werd geëvalueerd op 84 Belgische en Duitse veehouderijen met behulp van een vereenvoudigde ‘faecal egg count reduction test’ (FECRT). Op 39% van de bedrijven vertoonden MLs een onvoldoende werking. Na correctie voor de detectielimiet van de FECRT met behulp van Monte Carlo simulaties kon de verminderde werkzaamheid van de MLs enkel worden bevestigd in 25% van de bedrijven. Larvale identificatie van de nematodenspecies toonde aan dat alleen Cooperia species minder gevoelig waren voor MLs. De verminderde werkzaamheid van de MLs bleek eveneens significant geassocieerd te zijn met het bedrijfstype, met een lagere werkzaamheid bij vleesveebedrijven. In een tweede, gestandaardiseerde FECRT kon ivermectine resistentie nog enkel bevestigd worden op één van vier herbezochte bedrijven. Dit toont aan dat ML resistentie in C. oncophora voorkomt op Belgische rundveebedrijven, maar dat een onvoldoende werking van MLs vaak ook door andere factoren wordt veroorzaakt. Verder beschrijven we de evolutie van ML resistentie op een Belgisch vleesveebedrijf tussen 2006 en 2009. De aanwezigheid van ML-resistente C. oncophora op dit bedrijf werd voor het eerst opgemerkt in 2006. De werkzaamheid van ivermectine op dag 21 na de behandeling daalde van 73% in 2006, naar 40% in 2007, tot 0% in 2008. Daarentegen bleken BZs nog steeds doeltreffend te zijn op dit bedrijf. Ivermectine-resistente C. oncophora larven die verzameld werden in 2007 en 2008, werden gebruikt om een in vitro test voor ML resistentie te evalueren en voor de identificatie van moleculaire merkers voor ivermectine resistentie. Om een inzicht te krijgen in de moleculaire mechanismen van ML resistentie hebben we het doelwit gen van ivermectine onderzocht, GluClα3. De gDNA structuur van GluClα3 in C. oncophora bevat 21 exonen en omspant ongeveer 10kb van het gDNA. Het GluClα3 gen codeert via alternatieve splicing voor twee subeenheden, GluClα3A en α3B. De laatste subeenheid wordt verondersteld het belangrijkste doelwit te zijn van ivermectine. Een eerder aangetoond polymorfisme, L256F, bij een Brits ivermectine-resistent C. oncophora isolaat bleek niet aanwezig te zijn in de Belgische resistente C. oncophora isolaten. Echter, genetische analyses op deze isolaten gaven een verlies in allelische diversiteit van het GluClα3 gen aan. De resistente C. oncophora isolaten vertoonden geen aminozuur veranderingen in het GluClα3B gen die verband houden met ivermectine-resistentie. Daarentegen was het transcriptieniveau van GluCl α3A/B in L3 en volwassen C. oncophora wormen aanzienlijk lager in resistente wormen in vergelijking met gevoelige wormen. Benzimidazole resistentie is in verschillende nematoden sterk geassocieerd met specifieke aminozuur-veranderingen in het β-tubuline (Phe167Tyr; Glu198Ala; Phe200Tyr). Veelvuldig gebruik van de MLs zou deze nematoden predisponeren tot BZ resistentie. Opdat multiple resistentie een gevaar vormt voor de controle van GI nematoden hebben wij gezocht naar BZ resistentie-gerelateerde polymorfismen in onze ML resistente C. oncophora isolaten. Uit de pyrosequencing assay bleek echter dat deze BZ resistentie-gerelateerde polymorfismen niet aanwezig waren in de IVR C. oncophora isolaten. Tenslotte worden de mogelijkheden besproken om de bekomen resultaten te gebruiken in de ontwikkeling van een gevoelige moleculaire test en de toekomstige toepassingen ervan in het veld

Molecular mechanism of macrocyclic lactone resistance in the cattle parasites Ostertagia ostertagi and Cooperia oncophora

C

Replicative fitness of CCR5-using and CXCR4-using human immunodeficiency virus type 1 biological clones

CCR5-tropic viruses cause the vast majority of new HIV-1 infections while about half of the individuals infected with HIV-1 manifest a co-receptor switch (CCR5 (R5) to CXCR4 (X4)) prior to accelerated disease progression. The underlying biological mechanisms of X4 outgrowth in AIDS patients are still poorly understood. Although X4 viruses have been associated with increased "virulence" in vivo, in vitro replication and cytopathicity studies of X4 and R5 viruses have led to conflicting conclusions. We studied the replicative fitness of HIV-1 biological clones with different co-receptor tropism, isolated from four AIDS patients. On average, R5 and X4 clones replicated equally well in mitogen-activated T cells. In contrast, X4 variants were transferred more efficiently from dendritic cells to autologous CD4+ T cells. These observations suggest that interaction between X4 viruses, DC and T cells might contribute to the preferential outgrowth of X4 viruses in AIDS patients