Regulation of 3′ splice site selection after step 1 of splicing by spliceosomal C* proteins

Alternative precursor messenger RNA splicing is instrumental in expanding the proteome of higher eukaryotes, and changes in 3′ splice site (3'ss) usage contribute to human disease. We demonstrate by small interfering RNA–mediated knockdowns, followed by RNA sequencing, that many proteins first recruited to human C* spliceosomes, which catalyze step 2 of splicing, regulate alternative splicing, including the selection of alternatively spliced NAGNAG 3′ss. Cryo–electron microscopy and protein cross-linking reveal the molecular architecture of these proteins in C* spliceosomes, providing mechanistic and structural insights into how they influence 3'ss usage. They further elucidate the path of the 3′ region of the intron, allowing a structure-based model for how the C* spliceosome potentially scans for the proximal 3′ss. By combining biochemical and structural approaches with genome-wide functional analyses, our studies reveal widespread regulation of alternative 3′ss usage after step 1 of splicing and the likely mechanisms whereby C* proteins influence NAGNAG 3′ss choices

Functional study of human RNA Polymerase III subunits hRPC62 and hRPC39

Dans les cellules eucaryotes, la transcription de l’ADN nucléaire est effectuée grâce à trois ARN Polymérases ADN dépendantes (Pol). La Pol I transcrit les ARN ribosomaux, la Pol II produit essentiellement des ARN messagers et des micro ARN alors que la Pol III transcrit des petits ARN non traduits impliqués dans une variété de processus cellulaires essentiels tels que la traduction, l’épissage ou la régulation de la transcription. L’ARN Polymérase III humaine est un complexe enzymatique constitué de 17 sous-unités dont la plupart sont apparentées à des sous-unités de la Pol I et/ou la Pol II. Une de ces sous-unités, hRPC32 est présente sous forme de deux paralogues α et β codés par deux gènes différents où hRPC32β est exprimée de façon ubiquitaire alors que hRPC32α est exprimée spécifiquement dans les cellules transformées ou non différenciées. Au sein de la Pol III, hRPC32α/β, hRPC62 et hRPC39 forment un sous-complexe ternaire stable dissociable de l’enzyme. Ces trois sous-unités sont spécifiques à la Pol III et sont impliquées dans l’étape d’initiation de la transcription. L’objectif de ce travail de thèse est d’éclaircir les mécanismes de fonctionnement du sous-complexe hRPC62-hRPC39-hRPC32α/β. Le travail réalisé a permis, dans un premier temps, de cartographier les domaines d’interaction entre la sous-unité hRPC62 et les deux paralogues α et β de la sous-unité hRPC32. Ensuite, nous avons mené une analyse biochimique des activités enzymatiques des protéines recombinantes de hRPC62 et hRPC39. Cette analyse a montré que hRPC62 possède des homologies fonctionnelles avec TFIIEα, un facteur de transcription de l’ARN Polymérase II récemment décrit comme étant un homologue structural de la sous-unité hRPC62. Ces données supportent le modèle suggérant que certaines sous-unités des ARN Polymérases peuvent être considérées comme des facteurs de transcription recrutés de façon permanente à l’enzyme.In eukaryotes, nuclear transcription is carried out by DNA dependent RNA polymerases (Pol) I, II and III. Pol I transcribes ribosomal RNA’s, Pol II produces essentially messenger and micro RNA’s whereas Pol III transcribes small untranslated RNA’s involved in a variety of cellular processes such as translation, splicing or the regulation of transcription. Human Pol III is a multi-subunit enzyme composed of 17 subunits. The majority of these subunits are homologous or closely related to Pol II and/or Pol I subunits. However, five subunits are specific to Pol III with no counterparts in Pol I or Pol II. One of the Pol III specific subunits, hRPC32 has two paralogues, α and β, expressed from two different genes. hRPC32β is expressed ubiquitously while hRPC32α expression is specific to transformed or non-differentiated cells. Within the Pol III enzyme, hRPC32α or β associate with two other Pol III specific subunits, hRPC62 and hRPC39, to form stable ternary sub-complexes thought to be implicated in transcription initiation. The purpose of this work was to clarify the functional mechanism of hRPC32α/β-hRPC62-hRPC39 sub-complexes. In this study, we first mapped the protein-protein interaction of hRPC62 with hRPC32α and hRPC32β. Second, we performed a biochemical study of hRPC62 and hRPC39 enzymatic activities. This analysis showed that hRPC62 has functional homologies with TFIIEα, a Pol II transcription factor recently described as a structural homolog of hRPC62. These results support the model that certain RNA polymerase subunits can be considered as transcription factors that have been stably recruited to the enzyme

Etude fonctionnelle des sous-unités hRPC62 et hRPC39 de l’ARN Polymérase III humaine

In eukaryotes, nuclear transcription is carried out by DNA dependent RNA polymerases (Pol) I, II and III. Pol I transcribes ribosomal RNA’s, Pol II produces essentially messenger and micro RNA’s whereas Pol III transcribes small untranslated RNA’s involved in a variety of cellular processes such as translation, splicing or the regulation of transcription. Human Pol III is a multi-subunit enzyme composed of 17 subunits. The majority of these subunits are homologous or closely related to Pol II and/or Pol I subunits. However, five subunits are specific to Pol III with no counterparts in Pol I or Pol II. One of the Pol III specific subunits, hRPC32 has two paralogues, α and β, expressed from two different genes. hRPC32β is expressed ubiquitously while hRPC32α expression is specific to transformed or non-differentiated cells. Within the Pol III enzyme, hRPC32α or β associate with two other Pol III specific subunits, hRPC62 and hRPC39, to form stable ternary sub-complexes thought to be implicated in transcription initiation. The purpose of this work was to clarify the functional mechanism of hRPC32α/β-hRPC62-hRPC39 sub-complexes. In this study, we first mapped the protein-protein interaction of hRPC62 with hRPC32α and hRPC32β. Second, we performed a biochemical study of hRPC62 and hRPC39 enzymatic activities. This analysis showed that hRPC62 has functional homologies with TFIIEα, a Pol II transcription factor recently described as a structural homolog of hRPC62. These results support the model that certain RNA polymerase subunits can be considered as transcription factors that have been stably recruited to the enzyme.Dans les cellules eucaryotes, la transcription de l’ADN nucléaire est effectuée grâce à trois ARN Polymérases ADN dépendantes (Pol). La Pol I transcrit les ARN ribosomaux, la Pol II produit essentiellement des ARN messagers et des micro ARN alors que la Pol III transcrit des petits ARN non traduits impliqués dans une variété de processus cellulaires essentiels tels que la traduction, l’épissage ou la régulation de la transcription. L’ARN Polymérase III humaine est un complexe enzymatique constitué de 17 sous-unités dont la plupart sont apparentées à des sous-unités de la Pol I et/ou la Pol II. Une de ces sous-unités, hRPC32 est présente sous forme de deux paralogues α et β codés par deux gènes différents où hRPC32β est exprimée de façon ubiquitaire alors que hRPC32α est exprimée spécifiquement dans les cellules transformées ou non différenciées. Au sein de la Pol III, hRPC32α/β, hRPC62 et hRPC39 forment un sous-complexe ternaire stable dissociable de l’enzyme. Ces trois sous-unités sont spécifiques à la Pol III et sont impliquées dans l’étape d’initiation de la transcription. L’objectif de ce travail de thèse est d’éclaircir les mécanismes de fonctionnement du sous-complexe hRPC62-hRPC39-hRPC32α/β. Le travail réalisé a permis, dans un premier temps, de cartographier les domaines d’interaction entre la sous-unité hRPC62 et les deux paralogues α et β de la sous-unité hRPC32. Ensuite, nous avons mené une analyse biochimique des activités enzymatiques des protéines recombinantes de hRPC62 et hRPC39. Cette analyse a montré que hRPC62 possède des homologies fonctionnelles avec TFIIEα, un facteur de transcription de l’ARN Polymérase II récemment décrit comme étant un homologue structural de la sous-unité hRPC62. Ces données supportent le modèle suggérant que certaines sous-unités des ARN Polymérases peuvent être considérées comme des facteurs de transcription recrutés de façon permanente à l’enzyme