Homozygous NMNAT2 mutation in sisters with polyneuropathy and erythromelalgia.

We identified a homozygous missense mutation in the gene encoding NAD synthesizing enzyme NMNAT2 in two siblings with childhood onset polyneuropathy with erythromelalgia. No additional homozygotes for this rare allele, which leads to amino acid substitution T94M, were present among the unaffected relatives tested or in the 60,000 exomes of the ExAC database. For axons to survive, axonal NMNAT2 activity has to be maintained above a threshold level but the T94M mutation confers a partial loss of function both in the ability of NMNAT2 to support axon survival and in its enzymatic properties. Electrophysiological tests and histological analysis of sural nerve biopsies in the patients were consistent with loss of distal sensory and motor axons. Thus, it is likely that NMNAT2 mutation causes this pain and axon loss phenotype making this the first disorder associated with mutation of a key regulator of Wallerian-like axon degeneration in humans. This supports indications from numerous animal studies that the Wallerian degeneration pathway is important in human disease and raises important questions about which other human phenotypes could be linked to this gene

Readthrough of nonsense mutations in Rett syndrome: evaluation of novel aminoglycosides and generation of a new mouse model

Thirty-five percent of patients with Rett syndrome carry nonsense mutations in the MECP2 gene. We have recently shown in transfected HeLa cells that readthrough of nonsense mutations in the MECP2 gene can be achieved by treatment with gentamicin and geneticin. This study was performed to test if readthrough can also be achieved in cells endogenously expressing mutant MeCP2 and to evaluate potentially more effective readthrough compounds. A mouse model was generated carrying the R168X mutation in the MECP2 gene. Transfected HeLa cells expressing mutated MeCP2 fusion proteins and mouse ear fibroblasts isolated from the new mouse model were treated with gentamicin and the novel aminoglycosides NB30, NB54, and NB84. The localization of the readthrough product was tested by immunofluorescence. Readthrough of the R168X mutation in mouse ear fibroblasts using gentamicin was detected but at lower level than in HeLa cells. As expected, the readthrough product, full-length Mecp2 protein, was located in the nucleus. NB54 and NB84 induced readthrough more effectively than gentamicin, while NB30 was less effective. Readthrough of nonsense mutations can be achieved not only in transfected HeLa cells but also in fibroblasts of the newly generated Mecp2R168X mouse model. NB54 and NB84 were more effective than gentamicin and are therefore promising candidates for readthrough therapy in Rett syndrome patients

Characterization and experimental therapies of a new mouse model for Rett syndrome

Für das Rett Syndrom, eine der häufigsten genetischen Ursachen für mentale Retardie-rung bei Frauen, gibt es bisher keine kausale Therapie, obwohl gentherapeutische Studi-en mit konditionellen knockout Mäusen gezeigt haben, dass es sich um eine therapierbare Erkrankung handelt. Um neue Therapien entwickeln zu können, werden Mausmodelle benötigt, die auf den beim Menschen am häufigsten gefundenen Mutation beruhen. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Mausmodell mit der häufigsten humanen Nonsense-Mutation R168X im Mecp2 Gen charakterisiert. Mit Hilfe dieses Mausmodells wurden dann die Therapieansätze der „Stop-Codon Readthrough-Therapie“ und einer Knochenmarktransplantation auf ihre Wirksamkeit in vitro und in vivo untersucht. Die Charakterisierung der Mauslinie zeigte, dass männliche MeCP2R168X-Mäuse im Gegensatz zu anderen MeCP2-Mausmodellen kein verkürztes MeCP2 Protein exprimieren. Desweiteren weisen männliche MeCP2R168X-Mäuse einen Phänotyp, inklu-sive der drastisch verkürzten Lebenspanne, auf, wie er bei bereits etablierten Mausmo-dellen für das Rett Syndrom beschrieben wurde. Dagegen zeigten weibliche, heterozy-gote MeCP2R168X-Mäuse nur einen sehr mild ausgeprägten Phänotyp verglichen mit bereits etablierten MeCP2-Mauslinien. Für die „Stop-Codon Readthrough-Therapie“ wurde die Effizienz der Aminoglykoside Geniticin, Gentamicin und Neomycin, der Komponenten NB54, NB84 und NB124, sowie der niedermolekularen Substanz PTC124 auf ihre Wirksamkeit bei der Induktion eines Readthroughs mit transfizierten HeLa-Zellen und MeCP2R168X/y-Mausohrfibroblasten in vitro untersucht. Dabei zeigte sich eine deutliche Steigerung der Readthrough-Effizienz der NB-Komponenten, gemessen an der detektierbaren Menge an MeCP2, mit zunehmender Generation (NB54 --> NB84 --> NB124) und gegenüber dem klinisch angewandten Gentamicin. Während die Behandlung mit Neomycin zu einem minimalen Readthrough-Produkt führte, zeigte die Behandlung mit PTC124 kei-nen messbaren Readthrough. Anschließend wurden männliche MeCP2R168X-Mäuse mit den in vitro getesteten Sub-stanzen, mit Ausnahme von Geniticin, behandelt. Die Expression eines MeCP2-Proteins voller Länge konnte durch keine der applizierten Substanzen induziert werden. Auch bei Behandlungen über einen längeren Zeitraum mit hohen Dosierungen, im Fall von Gentamicin nahe der LD50-Dosis und nachweisbarer intrazellulärer Aufnahme, konnte in den behandelten Tieren weder ein verkürztes noch ein MeCP2 Protein nativer Länge detektiert werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass für die „Stop-Codon Readthrough-Therapie“ für das Rett Syndrom neue Komponenten entwickelt werden oder andere Applikationswege gewählt werden müssen, da mit den derzeit verfügbaren Substanzen kein therapeutischer Erfolg erzielt werden kann. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde die Theorie einer gestörten Phagozytose MeCP2-defizienter Mikroglia, sowie die Therapie von MeCP2-defizienten Mäusen durch eine Knochenmarktransplantation überprüft. Dabei konnte weder in vitro noch in vivo eine Veränderung der Phagozytoseaktivität der MeCP2-defizienten Mikroglia nachgewiesen werden, wie sie von Derecki und Kollegen publiziert wurde. Die Transplantation von gesundem Knochenmark führte bei männlichen MeCP2R168X-Tieren zu keiner Verlängerung der Überlebensspanne oder einer allgemeinen Abmilde-rung der Symptomatik, wie sie ebenfalls von Derecki und Kollegen publiziert wurde. Bei weiblichen Tieren führte die Transplantation gesunden Knochenmarks zu einer Verschlechterung der motorischen Fähigkeiten. Diese Ergebnisse sind im Einklang mit denen Ergebnissen der Arbeitsgruppen von An-drew Pieper, Antonio Bedalov und Jeffrey Neul, die in anderen Mausmodellen die Wir-kung der Knochenmarktransplantation untersuchten. Die Ergebnisse aller beteiligten Arbeitsgruppen legen daher nahe, dass eine Knochen-marktransplantation nach einer Ganzkörperbestrahlung keine geeignete Therapie für das Rett Syndroms darstellt

Evaluation of Novel Enhancer Compounds in Gentamicin-Mediated Readthrough of Nonsense Mutations in Rett Syndrome

Rett syndrome (RTT), a severe X-linked neurodevelopmental disorder, is primarily caused by mutations in the methyl CpG binding protein 2 gene (MECP2). Over 35% RTT patients carry nonsense mutation in MECP2, making it a suitable candidate disease for nonsense suppression therapy. In our previous study, gentamicin was found to induce readthrough of MECP2 nonsense mutations with modest efficiency. Given the recent discovery of readthrough enhancers, CDX compounds, we herein evaluated the potentiation effect of CDX5-1, CDX5-288, and CDX6-180 on gentamicin-mediated readthrough efficiency in transfected HeLa cell lines bearing the four most common MECP2 nonsense mutations. We showed that all three CDX compounds potentiated gentamicin-mediated readthrough and increased full-length MeCP2 protein levels in cells expressing the R168X, R255X, R270X, and R294X nonsense mutations. Among all three CDX compounds, CDX5-288 was the most potent enhancer and enabled the use of reduced doses of gentamicin, thus mitigating the toxicity. Furthermore, we successfully demonstrated the upregulation of full-length Mecp2 protein expression in fibroblasts derived from Mecp2R255X/Y mice through combinatorial treatment. Taken together, findings demonstrate the feasibility of this combinatorial approach to nonsense suppression therapy for a subset of RTT patients.Medicine, Faculty ofNon UBCBiochemistry and Molecular Biology, Department ofReviewedFacultyResearche

Homozygous NMNAT2 mutation in sisters with polyneuropathy and erythromelalgia.

We identified a homozygous missense mutation in the gene encoding NAD synthesizing enzyme NMNAT2 in two siblings with childhood onset polyneuropathy with erythromelalgia. No additional homozygotes for this rare allele, which leads to amino acid substitution T94M, were present among the unaffected relatives tested or in the 60,000 exomes of the ExAC database. For axons to survive, axonal NMNAT2 activity has to be maintained above a threshold level but the T94M mutation confers a partial loss of function both in the ability of NMNAT2 to support axon survival and in its enzymatic properties. Electrophysiological tests and histological analysis of sural nerve biopsies in the patients were consistent with loss of distal sensory and motor axons. Thus, it is likely that NMNAT2 mutation causes this pain and axon loss phenotype making this the first disorder associated with mutation of a key regulator of Wallerian-like axon degeneration in humans. This supports indications from numerous animal studies that the Wallerian degeneration pathway is important in human disease and raises important questions about which other human phenotypes could be linked to this gene

Characterization of the MeCP2^R168X Knockin Mouse Model for Rett Syndrome

<div><p>Rett syndrome, one of the most common causes of mental retardation in females, is caused by mutations in the X chromosomal gene <i>MECP2</i>. Mice deficient for MeCP2 recapitulate some of the symptoms seen in patients with Rett syndrome. It has been shown that reactivation of silent <i>MECP2</i> alleles can reverse some of the symptoms in these mice. We have generated a knockin mouse model for translational research that carries the most common nonsense mutation in Rett syndrome, R168X. In this article we describe the phenotype of this mouse model. In male MeCP2^R168X mice life span was reduced to 12–14 weeks and bodyweight was significantly lower than in wild type littermates. First symptoms including tremor, hind limb clasping and inactivity occurred at age 27 days. At age 6 weeks nest building, rotarod, open-field and elevated plus maze experiments showed impaired motor performance, reduced activity and decreased anxiety-like behavior. Plethysmography at the same time showed apneas and irregular breathing with reduced frequency. Female MeCP2^R168X mice showed no significant abnormalities except decreased performance on the rotarod at age 9 months. In conclusion we show that the male MeCP2^R168X mice have a phenotype similar to that seen in <i>MECP2</i> knockout mouse models and are therefore well suited for translational research. The female mice, however, have a much milder and less constant phenotype making such research with this mouse model more challenging.</p></div