Protein carbonylation as a mechanism of regulation of MCF-7 breast cancer cell proliferation

Tumor progression is accompanied by dysregulation of cell proliferation and apoptosis, which plays an essential role in breast cancer pathogenesis and cell resistance to chemotherapy. The role of protein carbonylation in molecular mechanisms of regulating MCF-7 breast cancer cell proliferation under the effect of roscovitine, a selective inhibitor of cyclin-dependent kinases, was evaluated. The cells were grown in adherent cell culture with or without roscovitine. The levels of reduced/oxidized glutathione and the concentration of protein carbonyl derivatives were determined by spectrophotometry. The cell cycle was evaluated by the flow cytometry; the same technique was used to measure the reactive oxygen species (ROS) concentration. Cell culture with roscovitine resulted in a decrease in the redox potential of the glutathione system and a rise in the ROS and protein carbonyl derivative concentrations. Roscovitine contributed to the G0/G1 and G2/М phase arrest due to its interaction with ATP-binding sites of cyclin-dependent kinases. Roscovitine could also promote enzyme carbonylation. The obtained results can be further used for development of personalized approaches to breast cancer therapy

Карбонилирование белков как возможный способ модуляции пролиферации клеток аденокарциномы молочной железы

Introduction. High rates of cancer incidence and mortality worldwide dictate the necessity of developing new methodological approaches in understanding the molecular mechanisms of cancer progression associated with intracellular redox regulation imbalance.The objective of the study was to evaluate the role of protein carbonylation in regulating breast cancer cell proliferation under redox status modulation.Materials and Methods. In the intact breast cancer cells and in the cells cultured under redox status modulation using 5mM N-ethylmaleimide (an - SH group blocker) and 5 Mm 1,4-dithioerythritol (a thiol group protector), the concentration of thioredoxin and its carbonylated form was measured using Western blot analysis. The activity of thioredoxin reductase and the level of protein carbonyl derivatives were determined using spectrophotometry. Cell cycle phase distribution was evaluated by flow cytometry.Results and Discussion. Under the effect of N-ethylmaleimide, cell cycle arrest in the S-phase was confirmed by oxidative modification of proteins, including thioredoxin carbonylation. When culturing MCF-7 cells in the presence of 1,4-dithioerythritol, cell cycle arrest in the G0/G1 phases was associated with a rise in the concentrations of reduced thioredoxin and glutathione forms.Conclusion. The thioredoxin system and oxidative modification of proteins are involved in redox-dependent modulation of breast cancer cell proliferation. Studies in the area of redox proteomics offer great potential to seek molecular targets of malignant transformation of breast cells.Введение. Нерешенная проблема растущей онкологической заболеваемости и смертности в мире ставит задачу разработки новых методических подходов в понимании молекулярных механизмов опухолевого роста, ассоциированного с дисбалансом редокс-регуляции внутриклеточных систем.Цель исследования - установить роль карбонилирования редокс-белков в регуляции пролиферации клеток аденокарциномы молочной железы при модуляции редокс-статуса.Материал и методы. В интактных клетках аденокарциномы молочной железы и культивируемых при модуляции редокс-статуса с использованием 5 мМ N-этилмалеимида (блокатор SH-групп белков и пептидов) и 5 мМ 1,4-дитиоэритритола (протектор тиоловых групп) определяли содержание тиоредоксина и его карбонилированной формы методом вестерн-блоттинга; активность тиоредоксинредуктазы и концентрацию карбонильных производных белков определяли спектрофотометрическим методом; распределение клеток по фазам клеточного цикла оценивали методом проточной цитофлуориметрии.Результаты. При действии N-этилмалеимида остановка пролиферации опухолевых клеток в S фазе была связана c окислительной модификацией белков, в том числе карбонилированием тиоредоксина. Остановка клеточного цикла в G0/G1 фазах при культивировании клеток линии МСF-7 в присутствии 1,4-дитиоэритритола сопровождалась увеличением содержания восстановленных форм тиоредоксина и глутатиона.Заключение. Редокс-зависимая модуляция пролиферации клеток аденокарциномы молочной железы осуществляется при участии системы тиоредоксина и окислительной модификации белков. Исследования в области редокс-регуляции представляются перспективными для поиска новых молекулярных мишеней опухолевой трансформации клеток молочной железы

Молекулярные механизмы влияния N-этилмалеимида и 1,4-дитиоэритритола на регуляцию апоптоза опухолевых клеток линии Р19 при гипоксии

Relevance. Impairment of apoptosis regulation in P19 cells is correlated with generation of oxidative stress. Under hypoxia, changes in mitochondrial functions occur, which may exacerbate oxidative stress in the tumor cell. The aim of the study was to evaluate the effects of N-ethylmaleimide and 1,4-dithioerythritol on implementation and regulation of apoptosis in P19 cells under hypoxia in vitro.Materials and methods. P19 cells (mouse teratocarcinoma) cultured under hypoxia served as the material for the study. For redox status modulation, 5mM N-ethylmaleimide and 1,4-dithioerythritol in the final concentrations of 5 mM were used. The intracellular concentration of calcium ions, the transmembrane potential and the number of Annexin V, CD95 and CD120 positive cells were determined by flow cytometry. The levels of reduced, oxidized and protein-bound glutathione, protein SH groups, hydroxyl radical and protein carbonyl derivatives were measured by spectrophotometry.Results. The alteration in the redox status of the glutathione system under hypoxia, accompanied by oxidative modification of proteins (glutathionylation and carbonylation), influences the metabolism in the tumor cell on the whole. Under the effects of 1,4-dithioerythritol, an SH group protector, this alteration promotes formation of additional mechanisms to escape apoptosis, whereas under the effects of N-ethylmaleimide, an SH group blocker, it, on the contrary, promotes apoptosis activation.Conclusions. The changes in the redox homeostasis of the tumor cell and modulation of oxidative modification of proteins (glutathionylation and carbonylation) under hypoxia are one of the promising approaches to targeted regulation of cell death.Актуальность. Нарушение регуляции апоптоза в эпителиальных опухолевых клетках линии Р19 сопряжено с формированием окислительного стресса. В условиях гипоксии происходит изменение функционирования митохондрий, что может выступать дополнительным фактором, усугубляющим  окислительный стресс в опухолевой клетке.Цель – оценить влияние N-этилмалеимида и 1,4-дитиоэритритола на реализацию и регуляцию апоптоза опухолевых клеток линии Р19 при гипоксии in vitro.Материалы и методы. Материалом для исследования служили культивированные в условиях гипоксии опухолевые клетки линии Р19 (тератокарцинома мыши). Для модуляции редокс-статуса использовали N-этилмалеимид в концентрации 5 мМ и протектор SH-групп – 1,4-дитиоэритритол в конечнойконцентрации 5 мМ. Методом проточной цитофлуориметрии определяли внутриклеточное содержание ионов кальция, трансмембранный потенциал митохондрий, количество аннексин V-, CD95- и CD120-положительных клеток. Концентрацию восстановленного, окисленного и белково-связанного глутатиона, SH-групп протеинов, гидроксильного радикала и карбонильных производных белков измеряли методом спектрофотомерии.Результаты. В условиях гипоксии изменение редокс-статуса системы глутатиона, сопровождающееся окислительной модификацией белков (глутатионилирование и карбонилирование), оказывает влияние на метаболизм опухолевой клетки в целом и, при применении протектора SH-групп белков – 1,4-дитиоэритритола, способствует формированию дополнительных механизмов ускользания от клеточной гибели, а в случае применения блокатора SH-групп протеинов – N-этилмалеимида – активации апоптоза.Заключение. В условиях гипоксии изменение редокс-гомеостаза опухолевой клетки и модуляция окислительной модификации белков (глутатионилирование и карбонилирование) являются одним из перспективных подходов таргетной регуляции клеточной гибели

Варианты течения псевдотуберкулеза у детей и вклад активации перекисного окисления липидов, дисбаланса антиоксидантной системы в их развитие

The objective is to compare clinical symptoms, lipid peroxidation indicators, the state of the antioxidant system and assess their impact on the severity and progression of pseudotuberculosis in children.Materials and methods. We examined 125 children with pseudotuberculosis divided into 4 groups according to the severity and nature of the disease progression and 45 healthy children. The material for the study was red blood cells and blood plasma of patients received in the dynamics – the acute period (during hospitalization); 3-4 weeks later – the phase of early convalescence with a non-smooth progression and moderate and heavy severity; the recovery period with a smooth progression and mild and moderate severity; 5-6 weeks later – the recovery period with a non-smooth progression and moderate and heavy severity. The spectrophotometric method was used to study lipid peroxidation (the concentration of diene conjugates, TBA-reactive substances) in the blood plasma and components of the antioxidant support system (the content of reduced glutathione; the activity of glutathione reductase, glutathione peroxidase, and catalase) in red blood cells.Results. It was determined that moderate and heavy pseudotuberculosis forms prevail in hospitalized children, the disease progression in 35.2% of them was non-smooth; lipid peroxidation products accumulate in the blood plasma and the concentration of reduced glutathione decreases in red blood cells during the acute period of pseudotuberculosis in all children relative to the parameters in the control group. In the period of early convalescence an imbalance in the functioning of antioxidant enzymes of red blood cells, as well as the accumulation of TBA-reactive substances and a decrease in the content of reduced glutathione were observed in patients with moderate and heavy pseudotuberculosis.Conclusion. The impact of the imbalance of pro-/antioxidants on the formation of predominantly moderate and heavy pseudotuberculosis in children is shown. Prognostic criteria for the development of a non-smooth progression of pseudotuberculosis are a high level of lipid peroxidation products in the blood plasma, no normalization in values of glutathione system components and the activity of erythrocyte catalase during early convalescence. Цель: сопоставить клинические симптомы, показатели перекисного окисления липидов, состояния антиоксидантной системы и оценить их вклад в степень тяжести и вариант течения псевдотуберкулеза у детей.Материалы и методы. Обследовано 125 детей, больных псевдотуберкулезом, разделенных на 4 группы по степени тяжести и характеру течения болезни, и 45 здоровых детей. Материалом для исследования служили эритроциты и плазма крови пациентов, полученные в динамике заболевания – острый период (при госпитализации); через 3–4 недели – фаза ранней реконвалесценции при негладком течении средней и тяжелой степени тяжести; период выздоровления при гладком течении легкой и средней степени тяжести; через 5–6 недель – период выздоровления при негладком течении средней и тяжелой степени тяжести. Спектрофотометрическим методом исследовали показатели перекисного окисления липидов (концентрацию диеновых конъюгатов, ТБК-реактивных продуктов) в плазме крови и компонентов системы антиоксидантной защиты (содержание восстановленного глутатиона; активность глутатионредуктазы, глутатионпероксидазы, каталазы) в эритроцитах.Результаты. Установили преобладание средней и тяжелой степени псевдотуберкулеза у госпитализированных детей, негладкое течение у 35,2% из них; накопление продуктов перекисного окисления липидов в плазме крови и снижение концентрации восстановленного глутатиона в эритроцитах в острый период псевдотуберкулеза у всех детей относительно показателей в группе контроля. В период ранней реконвалесценции у больных средней и тяжелой степени тяжести псевдотуберкулеза одновременно с накоплением ТБК-реактивных продуктов и снижением содержания восстановленного глутатиона наблюдался дисбаланс в работе ферментов антиоксидантной защиты эритроцитов.Заключение. Показан вклад дисбаланса про-/антиоксидантов в формирование преимущественно средней и тяжелой степеней псевдотуберкулеза у детей. Прогностическими критериями формирования негладкого течения псевдотуберкулеза являются высокий уровень продуктов перекисного окисления липидов в плазме крови, отсутствие нормализации показателей компонентов системы глутатиона и активности каталазы эритроцитов в период ранней реконвалесценции болезни.

Убиквитин и регуляция апоптоза опухолевых клеток линии Jurkat

Introduction. One of the crucial tasks in medicine is studying the molecular mechanisms of selective management of tumor cell apoptosis following conformational changes in protein molecules (ubiquitination).The purpose of the study. The aim of the project is to establish the role of ubiquitin and ubiquitinligase in dexamethasone-induced apoptosis in Jurkat cells.Materials and methods. The study was carried out on the Jurkat tumor cell line (intact cells and cells cultured in the presence of an apoptosis inducer dexamethasone in the final concentration of 10 µmol. In intact and dexamethasone-affected Jurkat cells, implementation of apoptosis and the amount of FAS-, TNF Receptor 1 and cells with reduced mitochondrial membrane potential were assessed by flow cytometry using FITC-conjugated Annexin V and Propidium Iodide. The levels of NF-κB, Apaf-1, ubiquitin and ubiquitin ligase were determined by Western blot analysis. The activity of caspase-3 was measured by spectrofluorometry.Results. When adding the apoptosis inducer dexamethasone to the Jurkat cell culture, we registered a fall in the concentration of ubiquitin and a rise in the level of ubiquitinligase against the backdrop of activated receptor(an increase in the amount of Annexin V positive cells, FASand TNF Receptor 1) and mitochondrialmediated (an increase in the number of cells with reduced mitochondrial membrane potential and elevation of Apaf-1 level) pathways of apoptosis, as opposed to the intact cell culture. We estimated the completion of apoptosis by determining the activity of caspase-3 in the investigated tumor cells.Conclusion. The obtained findings allow the conclusion that ubiquitination of regulatory and effector proteins in programmed cell death is one of the molecular mechanisms that regulates and selectively controls apoptosis in Jurkat cells.Актуальность. Одной из актуальных задач медицины является изучение молекулярных механизмов селективного управления апоптотической гибелью опухолевых клеток в результате конформационных изменений белковых молекул (убиквитинилирования). Цель исследования: установить роль убиквитина и убиквитинлигазы в дексаметазон-индуцированном апоптозе опухолевых клеток линии Jurkat.Материалы и методы. Интактные и культивированные при дополнительном добавлении индуктора апоптоза дексаметазона в конечной концентрации 10 мкМ опухолевые клетки линии Jurkat. Методом проточной цитофлуориметрии в интактных опухолевых клетках линии Jurkat и после предварительного воздействия дексаметазоном проводили оценку реализации апоптоза с использованием FITС-меченного аннексина V и пропидия иодида, количества FASи TNF-рецептор 1 положительных клеток со сниженным митохондриальным потенциалом. Методом вестерн-блоттинга определяли содержание транскрипционных факторов NF-κB, Apaf-1; убиквитина и убиквитинлигазы; активность каспазы-3 регистрировали спектрофлуориметрическим методом.Результаты. При добавлении дексаметазона – индуктора апоптоза – в среду культивирования опухолевых клеток линии Jurkat установлено снижение концентрации убиквитина и возрастание содержания убиквитинлигазы на фоне активации рецепторного (увеличение доли аннексин-, FASи TNFрецептор 1 положительных клеток) и митохондриального (возрастание числа клеток со сниженным митохондриальным потенциалом и содержания транскрипционного фактора Apaf-1) путей апоптоза по сравнению с интактной культурой опухолевых клеток. Завершенность апоптоза оценивали, определяя активность каспазы-3 в изучаемых клетках.Выводы. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что процесс убиквитинилирования белков-регуляторов и белков-эффекторов программированной гибели является одним из молекулярных механизмов регуляции апоптоза опухолевых клеток линии Jurkat

МЕХАНИЗМЫ ДИЗРЕГУЛЯЦИИ АПОПТОЗА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ЛИНИИ Р19 В УСЛОВИЯХ МОДУЛЯЦИИ РЕДОКС-СТАТУСА

Introduction. Changes in the redox status of tumor cells can be used as one of the molecular mechanisms of apoptosis aimed at increasing the susceptibility of tumor cells to chemotherapeutic agents. Purpose: to study the mechanisms of dysregulation of apoptosis in P19 tumor cells under the conditions of redox status modulation. Material and methods. Apoptosis in P19 tumor cells was assessed by flow cytometry analysis. The number of annexin-positive cells, the expression of CD95 and CD120, as well as the intracellular calcium ion concentration and the percentage of cells with reduced mitochondrial transmembrane potential were measured. The protein-glutathione mixed-disulfide level and the GSH/GSSG ratio were determined by spectrophotometry. To modulate redox status of cells, the protector and blocker of SH-groups, or N-acetylcysteine were used. Results. Incubation of cultures in the presence of SH-group blocker resulted in the imbalance in the glutathione system with increased concentration of glutathionylated proteins. A decreased redox status led to an increased CD95 and CD120 expression levels on the membrane of P19 tumor cells, as well as to decreased mitochondrial potential and increased intracellular calcium ion concentration, thus contributing to the launch of a P19 tumor cells. The presence of SH-group blocker and N-acetylcysteine resulted in an increased number of annexinpositive cells. Conclusion. Along with the development of oxidative stress, the molecular redox-dependent mechanisms of apoptosis dysregulation through the mitochondrial and receptor-mediated pathways were identified in the P19 tumor cells.Введение. Изменение редокс-статуса опухолевых клеток может использоваться как один из молекулярных механизмов регуляции апоптоза, нацеленный на повышение восприимчивости опухолевых клеток к действию химиотерапевтических агентов. Цель исследования – изучение механизмов дизрегуляции апоптоза опухолевых клеток линии Р19 в условиях модуляции редокс-статуса. материал и методы. В ходе проведенного исследования комплексную оценку апоптоза в клетках опухолевой линии Р19 осуществляли методом проточной цитофлюориметрии. Определяли количество аннексинположительных клеток, экспрессию CD95 и CD120, а также процент клеток со сниженным трансмембранным потенциалом и внутриклеточную концентрацию ионов кальция. Содержание белковосвязанного глутатиона и величину соотношения восстановленной формы трипептида к окисленной определяли спектрофотометрическим методом. Для модуляции редокс-статуса использовали блокатор или протектор SH-групп, либо N-ацетилцистеин. результаты. Инкубация культуры в присутствии блокатора SH-групп приводила к дисбалансу системы глутатиона на фоне увеличения содержания его фракции, связанной с белками. Снижение редокс-статуса приводило к увеличению экспрессии CD95 и CD120 на мембране опухолевых клеток линии Р19, а также к снижению митохондриального потенциала и повышению внутриклеточной концентрации ионов кальция, что способствовало запуску апоптоза. Количество аннексин-положительных клеток увеличивалось при действии блокатора SH-групп и в присутствии N-ацетилцистеина. Заключение. В опухолевых клетках линии Р19 на фоне развития окислительного стресса выявлены молекулярные редокс-зависимые механизмы дизрегуляции апоптоза по митохондриальному и рецепторопосредованному пути