Activités anticancéreuses des antagonistes perméants des récepteurs B1 et B2 des kinines dans un modèle cellulaire de cancer du sein triple-négatif

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) sont des protéines de surfaces intégrales qui jouent un rôle central dans la croissance et la progression tumorale ainsi que la formation de métastases. Toutefois, plusieurs de ces RCPGs possèdent une localisation intracellulaire/nucléaire atypique dans plusieurs types de cancers. La signification pathologique de cette localisation demeure inconnue encore à ce jour. Les données exploratoires obtenues dans notre laboratoire démontrent que les récepteurs RCPG nucléaires des kinines, rB1 et rB2, sont surexprimés dans des lignées de cancer du sein agressives triple-négatives telles que les MDA-MB-231 ainsi que des spécimens cliniques. En nous basant sur ces données, nous avons émis l’hypothèse que ces récepteurs «nucléarisés» sont impliqués dans la signalisation oncogénique liée à la croissance aberrante et le maintien de la survie des cellules de cancer du sein. Nous avons caractérisé d’une part de nouveaux antagonistes perméants des récepteurs B1 et B2 des kinines et d’autre part, démontré leur efficacité supérieure par rapport aux antagonistes non perméants à inhiber la prolifération et à induire l’apoptose des cellules MDA-MB-231. Certains de ces antagonistes perméants ont démontré in vitro des activités anticancéreuses supérieures aux agents chimiothérapeutiques actuellement utilisés en clinique. De plus, ces antagonistes perméants ont montré peu ou pas d’effets sur deux lignées cellulaires n’exprimant pas les récepteurs des kinines soit les MCF-10A, une lignée cellulaire normale du sein ainsi que sur les COS-1 une lignée cellulaire normale de rein de singe indiquant ainsi une spécificité de leur action. L’incubation des cellules avec les antagonistes perméants entraine des modifications dans l’activité de certaines kinases (ex. p38) ainsi que dans l’expression de protéines impliquées dans le cycle cellulaire et l’apoptose. Nous avons également utilisé des cellules knockdown (de rB2 uniquement) pour d’une part, consolider la spécificité d’action des nouveaux antagonistes perméants et d’autre part, démontrer l’importance des récepteurs des kinines dans la croissance des cellules tumorales in vitro. Nos résultats montrent un rôle central des récepteurs intracellulaires/nucléaires des kinines dans la prolifération et le maintien de la viabilité des cellules de cancer du sein. Les données obtenues montrent également l’importance de cibler un RCPG en fonction de sa localisation subcellulaire pour obtenir une meilleure efficacité dans le traitement du cancer

Utilisation d'analogues du bombesin dans le diagnostic et le traitement du cancer du sein et de la prostate

Un diagnostic précoce suivi d'un traitement efficace et bien adapté au type de cancer sont les deux aspects les plus importants dans le traitement du cancer. L'imagerie par tomographie d'émission de positrons (TEP) est utilisée en oncologie pour le diagnostic ainsi que l'évaluation de la réponse a la thérapie. La TEP est l'outil le plus efficace dans la détection du cancer, des métastases ainsi que des récidives. Le radiotraceur le plus utilisé présentement en clinique est le 2-deoxy-2-[[exposant 18]F]-fluoro-D-glucose ([[exposant 18]F]-FDG). Ce radiotraceur est un analogue du glucose qui permet de détecter les tumeurs et d'évaluer le métabolisme de ces cellules. En effet, les cellules tumorales ont généralement un métabolisme beaucoup plus élevé que les cellules normales. L'imagerie est donc basé sur l'accumulation du radiotraceur plus rapidement dans les cellules tumorales. Malheureusement, certains types de cellules cancéreuses tels que les cellules de cancer de la prostate ont un métabolisme peu élevé et alors, le [[exposant 18]F]-FDG s'avère inefficace dans la détection de ces types de cancers. L'inverse est aussi vrai et pose également problème, c'est-à-dire que certains types de cellules saines ont un métabolisme élevé et, dans ces cas, le [[exposant 18]F]-FDG est, la aussi, inadéquat, tel que dans le cas du cancer du cerveau, par exemple, où les cellules du cerveau ont un métabolisme très élevé en tout temps rendant l'imagerie de ce cancer impossible. Même si le [[exposant 18]F]- FDG demeure un bon radiotraceur dans la majorité des cas, le développement de nouveaux radiotraceurs capables de cibler spécifiquement les cellules cancéreuses présente des avantages indéniables. Plusieurs traitements sont disponibles présentement en clinique pour traiter le cancer. Malheureusement, tous ces traitements comportent certaines lacunes dont la plus importante et la plus commune est la présence d'effets secondaires importants. Ces effets secondaires sont dus au manque de spécificité des molécules utilisées dans ces traitements. En effet, ces agents thérapeutiques ne ciblent pas spécifiquement les cellules cancéreuses, mais bien toutes les cellules en division, causant aussi des dommages aux cellules saines. La photothérapie est l'un de ces traitements éprouvés en clinique dont l'efficacité pour traiter certains types de cancers a déjà été demontrée. La présence d'un agent ciblant les cellules cancéreuses spécifiquement pourrait grandement améliorer l'efficacité et diminuer les effets secondaires. Le bombesin est un peptide de 14 acides aminés qui est exprimé chez plusieurs types cellulaires et qui possède plusieurs fonctions de régulation dans l'organisme. Ainsi, il participe à la thermorégulation, en plus de provoquer la sécrétion de plusieurs enzymes pancréatiques. Ce peptide doit son nom à la grenouille Bombina bombina chez laquelle il fut d'abord isolé et séquencé. Par la suite, son équivalent humain, le gastrin-releasing peptide (GRP), fut découvert et son étude démontra que ce peptide est hautement conservé chez les différentes espèces. Quatre sous-types ont été identifiés chez la grenouille et trois chez l'humain. Les récepteurs a bombesin sont exprimés en très bas niveau chez plusieurs types cellulaires normaux, mais ils sont particulièrement surexprimés chez certains types de cancers tels que le cancer du sein et de la prostate. De plus, la surexpression de certains sous-types tels que le gastrin-releasing peptide receptor (GRPR) est un indice de l'agressivité de la tumeur. Notre premier objectif était donc de créer un radiopeptide qui se lierait spécifiquement à des récepteurs surexprimés dans des cas de cancer du sein et de la prostate, les GRPR pour permettre l'imagerie TEP de ces types de tumeurs. En combinant un analogue du bombesin avec un radioisotope, le Cu-64, nous voulions obtenir un radiotraceur plus spécifique que celui utilisé présentement en clinique. Notre second objectif était d'évaluer le potentiel de ce même analogue du bombesin lié à un photosensibilisateur, l'AIPcS[indice inférieur 4]A[indice inférieur 1], en tant qu'agent photosensibilisant dans l'utilisation de la thérapie photodynamique (TPD) dans le traitement du cancer de la prostate

Targeting intracellular B2 receptors using novel cell-penetrating antagonists to arrest growth and induce apoptosis in human triple-negative breast cancer

G protein-coupled receptors (GPCRs) are integral cell-surface proteins having a central role in tumor growth and metastasis. However, several GPCRs retain an atypical intracellular/nuclear location in various types of cancer. The pathological significance of this is currently unknown. Here we extend this observation by showing that the bradykinin B2R (BK-B2R) is nuclearly expressed in the human triple-negative breast cancer (TNBC) cell line MDA-MB-231 and in human clinical specimens of TNBC. We posited that these "nuclearized" receptors could be involved in oncogenic signaling linked to aberrant growth and survival maintenance of TNBC. We used cell-penetrating BK-B2R antagonists, including FR173657 and novel transducible, cell-permeable forms of the peptide B2R antagonist HOE 140 (NG68, NG134) to demonstrate their superior efficacy over impermeable ones (HOE 140), in blocking proliferation and promoting apoptosis of MDA-MB-231 cells. Some showed an even greater antineoplastic activity over conventional chemotherapeutic drugs in vitro. The cell-permeable B2R antagonists had less to no anticancer effects on B2R shRNA-knockdown or non-B2R expressing (COS-1) cells, indicating specificity in their action. Possible mechanisms of their anticancer effects may involve activation of p38kinase/p27Kip1pathways. Together, our data support the existence of a possible intracrine signaling pathway via internal/nuclear B2R, critical for the growth of TNBC cells, and identify new chemical entities that enable to target the corresponding intracellular GPCRs

The Human Gonadotropin Releasing Hormone Type I Receptor Is a Functional Intracellular GPCR Expressed on the Nuclear Membrane

The mammalian type I gonadotropin releasing hormone receptor (GnRH-R) is a structurally unique G protein-coupled receptor (GPCR) that lacks cytoplasmic tail sequences and displays inefficient plasma membrane expression (PME). Compared to its murine counterparts, the primate type I receptor is inefficiently folded and retained in the endoplasmic reticulum (ER) leading to a further reduction in PME. The decrease in PME and concomitant increase in intracellular localization of the mammalian GnRH-RI led us to characterize the spatial distribution of the human and mouse GnRH receptors in two human cell lines, HEK 293 and HTR-8/SVneo. In both human cell lines we found the receptors were expressed in the cytoplasm and were associated with the ER and nuclear membrane. A molecular analysis of the receptor protein sequence led us to identify a putative monopartite nuclear localization sequence (NLS) in the first intracellular loop of GnRH-RI. Surprisingly, however, neither the deletion of the NLS nor the addition of the Xenopus GnRH-R cytoplasmic tail sequences to the human receptor altered its spatial distribution. Finally, we demonstrate that GnRH treatment of nuclei isolated from HEK 293 cells expressing exogenous GnRH-RI triggers a significant increase in the acetylation and phosphorylation of histone H3, thereby revealing that the nuclear-localized receptor is functional. Based on our findings, we conclude that the mammalian GnRH-RI is an intracellular GPCR that is expressed on the nuclear membrane. This major and novel discovery causes us to reassess the signaling potential of this physiologically and clinically important receptor

Induction of Selective Blood-Tumor Barrier Permeability and Macromolecular Transport by a Biostable Kinin B1 Receptor Agonist in a Glioma Rat Model

Treatment of malignant glioma with chemotherapy is limited mostly because of delivery impediment related to the blood-brain tumor barrier (BTB). B1 receptors (B1R), inducible prototypical G-protein coupled receptors (GPCR) can regulate permeability of vessels including possibly that of brain tumors. Here, we determine the extent of BTB permeability induced by the natural and synthetic peptide B1R agonists, LysdesArg9BK (LDBK) and SarLys[dPhe8]desArg9BK (NG29), in syngeneic F98 glioma-implanted Fischer rats. Ten days after tumor inoculation, we detected the presence of B1R on tumor cells and associated vasculature. NG29 infusion increased brain distribution volume and uptake profiles of paramagnetic probes (Magnevist and Gadomer) at tumoral sites (T1-weighted imaging). These effects were blocked by B1R antagonist and non-selective cyclooxygenase inhibitors, but not by B2R antagonist and non-selective nitric oxide synthase inhibitors. Consistent with MRI data, systemic co-administration of NG29 improved brain tumor delivery of Carboplatin chemotherapy (ICP-Mass spectrometry). We also detected elevated B1R expression in clinical samples of high-grade glioma. Our results documented a novel GPCR-signaling mechanism for promoting transient BTB disruption, involving activation of B1R and ensuing production of COX metabolites. They also underlined the potential value of synthetic biostable B1R agonists as selective BTB modulators for local delivery of different sized-therapeutics at (peri)tumoral sites

Activités anticancéreuses des antagonistes perméants des récepteurs B1 et B2 des kinines dans un modèle cellulaire de cancer du sein triple-négatif

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) sont des protéines de surfaces intégrales qui jouent un rôle central dans la croissance et la progression tumorale ainsi que la formation de métastases. Toutefois, plusieurs de ces RCPGs possèdent une localisation intracellulaire/nucléaire atypique dans plusieurs types de cancers. La signification pathologique de cette localisation demeure inconnue encore à ce jour. Les données exploratoires obtenues dans notre laboratoire démontrent que les récepteurs RCPG nucléaires des kinines, rB1 et rB2, sont surexprimés dans des lignées de cancer du sein agressives triple-négatives telles que les MDA-MB-231 ainsi que des spécimens cliniques. En nous basant sur ces données, nous avons émis l’hypothèse que ces récepteurs «nucléarisés» sont impliqués dans la signalisation oncogénique liée à la croissance aberrante et le maintien de la survie des cellules de cancer du sein. Nous avons caractérisé d’une part de nouveaux antagonistes perméants des récepteurs B1 et B2 des kinines et d’autre part, démontré leur efficacité supérieure par rapport aux antagonistes non perméants à inhiber la prolifération et à induire l’apoptose des cellules MDA-MB-231. Certains de ces antagonistes perméants ont démontré in vitro des activités anticancéreuses supérieures aux agents chimiothérapeutiques actuellement utilisés en clinique. De plus, ces antagonistes perméants ont montré peu ou pas d’effets sur deux lignées cellulaires n’exprimant pas les récepteurs des kinines soit les MCF-10A, une lignée cellulaire normale du sein ainsi que sur les COS-1 une lignée cellulaire normale de rein de singe indiquant ainsi une spécificité de leur action. L’incubation des cellules avec les antagonistes perméants entraine des modifications dans l’activité de certaines kinases (ex. p38) ainsi que dans l’expression de protéines impliquées dans le cycle cellulaire et l’apoptose. Nous avons également utilisé des cellules knockdown (de rB2 uniquement) pour d’une part, consolider la spécificité d’action des nouveaux antagonistes perméants et d’autre part, démontrer l’importance des récepteurs des kinines dans la croissance des cellules tumorales in vitro. Nos résultats montrent un rôle central des récepteurs intracellulaires/nucléaires des kinines dans la prolifération et le maintien de la viabilité des cellules de cancer du sein. Les données obtenues montrent également l’importance de cibler un RCPG en fonction de sa localisation subcellulaire pour obtenir une meilleure efficacité dans le traitement du cancer

Utilisation d'analogues du bombesin dans le diagnostic et le traitement du cancer du sein et de la prostate

Un diagnostic précoce suivi d'un traitement efficace et bien adapté au type de cancer sont les deux aspects les plus importants dans le traitement du cancer. L'imagerie par tomographie d'émission de positrons (TEP) est utilisée en oncologie pour le diagnostic ainsi que l'évaluation de la réponse a la thérapie. La TEP est l'outil le plus efficace dans la détection du cancer, des métastases ainsi que des récidives. Le radiotraceur le plus utilisé présentement en clinique est le 2-deoxy-2-[[exposant 18]F]-fluoro-D-glucose ([[exposant 18]F]-FDG). Ce radiotraceur est un analogue du glucose qui permet de détecter les tumeurs et d'évaluer le métabolisme de ces cellules. En effet, les cellules tumorales ont généralement un métabolisme beaucoup plus élevé que les cellules normales. L'imagerie est donc basé sur l'accumulation du radiotraceur plus rapidement dans les cellules tumorales. Malheureusement, certains types de cellules cancéreuses tels que les cellules de cancer de la prostate ont un métabolisme peu élevé et alors, le [[exposant 18]F]-FDG s'avère inefficace dans la détection de ces types de cancers. L'inverse est aussi vrai et pose également problème, c'est-à-dire que certains types de cellules saines ont un métabolisme élevé et, dans ces cas, le [[exposant 18]F]-FDG est, la aussi, inadéquat, tel que dans le cas du cancer du cerveau, par exemple, où les cellules du cerveau ont un métabolisme très élevé en tout temps rendant l'imagerie de ce cancer impossible. Même si le [[exposant 18]F]- FDG demeure un bon radiotraceur dans la majorité des cas, le développement de nouveaux radiotraceurs capables de cibler spécifiquement les cellules cancéreuses présente des avantages indéniables. Plusieurs traitements sont disponibles présentement en clinique pour traiter le cancer. Malheureusement, tous ces traitements comportent certaines lacunes dont la plus importante et la plus commune est la présence d'effets secondaires importants. Ces effets secondaires sont dus au manque de spécificité des molécules utilisées dans ces traitements. En effet, ces agents thérapeutiques ne ciblent pas spécifiquement les cellules cancéreuses, mais bien toutes les cellules en division, causant aussi des dommages aux cellules saines. La photothérapie est l'un de ces traitements éprouvés en clinique dont l'efficacité pour traiter certains types de cancers a déjà été demontrée. La présence d'un agent ciblant les cellules cancéreuses spécifiquement pourrait grandement améliorer l'efficacité et diminuer les effets secondaires. Le bombesin est un peptide de 14 acides aminés qui est exprimé chez plusieurs types cellulaires et qui possède plusieurs fonctions de régulation dans l'organisme. Ainsi, il participe à la thermorégulation, en plus de provoquer la sécrétion de plusieurs enzymes pancréatiques. Ce peptide doit son nom à la grenouille Bombina bombina chez laquelle il fut d'abord isolé et séquencé. Par la suite, son équivalent humain, le gastrin-releasing peptide (GRP), fut découvert et son étude démontra que ce peptide est hautement conservé chez les différentes espèces. Quatre sous-types ont été identifiés chez la grenouille et trois chez l'humain. Les récepteurs a bombesin sont exprimés en très bas niveau chez plusieurs types cellulaires normaux, mais ils sont particulièrement surexprimés chez certains types de cancers tels que le cancer du sein et de la prostate. De plus, la surexpression de certains sous-types tels que le gastrin-releasing peptide receptor (GRPR) est un indice de l'agressivité de la tumeur. Notre premier objectif était donc de créer un radiopeptide qui se lierait spécifiquement à des récepteurs surexprimés dans des cas de cancer du sein et de la prostate, les GRPR pour permettre l'imagerie TEP de ces types de tumeurs. En combinant un analogue du bombesin avec un radioisotope, le Cu-64, nous voulions obtenir un radiotraceur plus spécifique que celui utilisé présentement en clinique. Notre second objectif était d'évaluer le potentiel de ce même analogue du bombesin lié à un photosensibilisateur, l'AIPcS[indice inférieur 4]A[indice inférieur 1], en tant qu'agent photosensibilisant dans l'utilisation de la thérapie photodynamique (TPD) dans le traitement du cancer de la prostate

Effect of epitope tag on hGnRH-RI signaling and spatial localization of FLAG-hGnRH-RI.

<p>(A) Inositol phosphate (IP) production in response to 100 nM Buserelin was assessed as described in “<a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0011489#s4" target="_blank">Materials and Methods</a>”. Data represent three to six independent experiments performed in triplicate and normalized to FLAG-hGnRHRI ± S.E. (B, left) HTR-8/SVneo cells transfected with either FLAG-hGnRH-RI (a) subjected to indirect immunofluorescent staining using affinity purified rabbit anti-FLAG antibody followed by Alexa Fluor 568-conjugated anti-rabbit IgG (<i>red</i>) and counterstained with the nuclear dye, Hoechst (<i>blue</i>). Note the perinuclear localization of the FLAG-tagged hGnRH-RI (<i>a</i>, <i>arrow</i>); (B, right) HTR-8/SVneo cell transfected with GnRH-RI-GFP and counterstained with the nuclear dye, Hoechst (<i>blue</i>). Note the perinuclear localization of the GnRH-RI-GFP. (C) HTR-8/SVneo and HEK 293 cells transfected with FLAG-hGnRH-RI were subjected to indirect immunofluorescent staining using affinity purified rabbit anti-FLAG antibody followed by Alexa Fluor 568-conjugated anti-rabbit IgG (<i>red</i>) and counterstained with Hoechst (<i>blue</i>). Note the perinuclear localization of the FLAG-tagged hGnRH-RI seen in both cell lines (<i>arrows</i>). Bright field images are shown in the second column from the left. (D) Western blot analysis was performed on the lysates of nuclei isolated from HEK 293 cells overexpressing FLAG-GnRH-RI. The results reveal that the full length hGnRH-RI is expressed on the nuclei of HEK 293 cells. (E) Cells expressing FLAG-hGnRH-RI were subjected to indirect immunofluorescent staining for the receptor (red) as well as the nuclear membrane, endoplasmic reticulum and Golgi (<i>all shown in green</i>). Colocalization is seen as yellow staining. Column A: receptor alone; Column B: receptor + Hoescht; Column C: organelle marker (lamin A/C, calnexin or GM130) + Hoescht; Column D: receptor + organelle marker. Column letters and roman numerals used as a coordinate system. hGnRH-RI immunoreactivity co-localized with the nuclear marker, lamin A/C, as seen by the yellow staining (I-D, II-D, <i>arrows</i>) as well as with the endoplasmic reticulum marker, calnexin (III-D, IV-D). Less colocalization was seen between the receptor and the Golgi, as shown by less yellow staining (V-D, VI-D). Scale bar = 10 µm.</p

Proteins containing a putative monopartite NLS related to that found in the human gonadotropin releasing hormone receptor isoform 1.

<p>Proteins containing a putative monopartite NLS related to that found in the human gonadotropin releasing hormone receptor isoform 1.</p