Analyse des voies de régulation de la cardiogenèse et de la différenciation cardiomyocytaire

The general objective of this work was centered on the use of human induced pluripotent cells in modeling and therapeutic evaluation of cardiac pathologies. Since their discovery in 2006, the iPSC provide an opportunity for the development of human cellular models and specific patients for the study of pathophysiological mechanisms, evaluation of pharmacological responses and the generation redifférenciées cells (cardiomyocytes here) for applications cellular therapeutic. In this work we demonstrated that the quantity but also the final quality of cardiomyocytes derived from iPSC depends on the spatial and pharmacological conditions used during the various stages of differentiation. The use of a monolayer differentiation protocol with simultaneous and transient blocking of all Wnt pathways (canonical and noncanonical) allows to obtain a higher maturation of the sarcomere, an essential step for modeling sarcomeropathies IPSC differentiation into cardiomyocytes can also be obtained by targeted molecular approach to specifically activate cardiogenic program. This is achieved through the use of a mutated Cas9 protein and coupled with transactivator system. This allows simultaneous targeting of 3 key cardiogenesis transcription factors (Gata4, MEF2C and Tbx5). This molecular approach is enhanced by the combination with a pharmacological stimulation targeting the Wnt pathway. Beyond modeling of monogenic cardiac disease, cardiomyocytes derived from iPSC can reproduce more complex and multigenic diseasesL'objectif général de ce travail de doctorat a été centré sur l'utilisation des cellules pluripotentes induites humaines dans la modélisation et l'évaluation thérapeutique des pathologies cardiaques. Depuis leur découverte en 2006, les iPSC offrent une opportunité pour le développement de modèles cellulaires humains et spécifiques de patients pour l'étude des mécanismes physiopathologiques, l'évaluation de réponses pharmacologiques et le génération de cellules redifférenciées (ici en cardiomyocytes) pour des applications thérapeutiques cellulaires. Dans ce travail nous avons démontré que la quantité mais aussi la qualité finale des cardiomyocytes dérivés d'iPSC dépend des conditions spatiales et pharmacologiques utilisées durant les différentes étapes de différenciation. L'utilisation d'un protocole de différentiation en monocouche avec blocage simultané et transitoire de l'ensemble des voies Wnt (canoniques et non canoniques) permet d'obtenir une maturation plus importante du sarcomère, étape essentielle pour la modélisation des sarcomèropathies La différenciation des iPSC en cardiomyocytes peut aussi être obtenue par une approche moléculaire ciblée visant à activer spécifiquement un programme cardiogénique. Celle-ci est obtenue via l'utilisation d'une protéine Cas9 mutée et couplée à un système transactivateur et permettant le ciblage simultané de 3 facteurs de transcription clés de la cardiogénèse (Gata4, Mef2c et Tbx5). Cette approche moléculaire est renforcée par la combinaison avec une stimulation pharmacologique ciblant la voie Wnt

Analysis of the cardiogenenis pathways and the cardiac differentiation

L'objectif général de ce travail de doctorat a été centré sur l'utilisation des cellules pluripotentes induites humaines dans la modélisation et l'évaluation thérapeutique des pathologies cardiaques. Depuis leur découverte en 2006, les iPSC offrent une opportunité pour le développement de modèles cellulaires humains et spécifiques de patients pour l'étude des mécanismes physiopathologiques, l'évaluation de réponses pharmacologiques et le génération de cellules redifférenciées (ici en cardiomyocytes) pour des applications thérapeutiques cellulaires. Dans ce travail nous avons démontré que la quantité mais aussi la qualité finale des cardiomyocytes dérivés d'iPSC dépend des conditions spatiales et pharmacologiques utilisées durant les différentes étapes de différenciation. L'utilisation d'un protocole de différentiation en monocouche avec blocage simultané et transitoire de l'ensemble des voies Wnt (canoniques et non canoniques) permet d'obtenir une maturation plus importante du sarcomère, étape essentielle pour la modélisation des sarcomèropathies La différenciation des iPSC en cardiomyocytes peut aussi être obtenue par une approche moléculaire ciblée visant à activer spécifiquement un programme cardiogénique. Celle-ci est obtenue via l'utilisation d'une protéine Cas9 mutée et couplée à un système transactivateur et permettant le ciblage simultané de 3 facteurs de transcription clés de la cardiogénèse (Gata4, Mef2c et Tbx5). Cette approche moléculaire est renforcée par la combinaison avec une stimulation pharmacologique ciblant la voie Wnt.The general objective of this work was centered on the use of human induced pluripotent cells in modeling and therapeutic evaluation of cardiac pathologies. Since their discovery in 2006, the iPSC provide an opportunity for the development of human cellular models and specific patients for the study of pathophysiological mechanisms, evaluation of pharmacological responses and the generation redifférenciées cells (cardiomyocytes here) for applications cellular therapeutic. In this work we demonstrated that the quantity but also the final quality of cardiomyocytes derived from iPSC depends on the spatial and pharmacological conditions used during the various stages of differentiation. The use of a monolayer differentiation protocol with simultaneous and transient blocking of all Wnt pathways (canonical and noncanonical) allows to obtain a higher maturation of the sarcomere, an essential step for modeling sarcomeropathies IPSC differentiation into cardiomyocytes can also be obtained by targeted molecular approach to specifically activate cardiogenic program. This is achieved through the use of a mutated Cas9 protein and coupled with transactivator system. This allows simultaneous targeting of 3 key cardiogenesis transcription factors (Gata4, MEF2C and Tbx5). This molecular approach is enhanced by the combination with a pharmacological stimulation targeting the Wnt pathway. Beyond modeling of monogenic cardiac disease, cardiomyocytes derived from iPSC can reproduce more complex and multigenic disease

Modéliser la myopathie myofibrillaire pour élucider la pathogenèse cardiaque

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Differential Sarcomere and Electrophysiological Maturation of Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes in Monolayer vs. Aggregation-Based Differentiation Protocols

Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) represent a powerful human model to study cardiac disease in vitro, notably channelopathies and sarcomeric cardiomyopathies. Different protocols for cardiac differentiation of iPSCs have been proposed either based on embroid body formation (3D) or, more recently, on monolayer culture (2D). We performed a direct comparison of the characteristics of the derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) on day 27 ± 2 of differentiation between 3D and 2D differentiation protocols with two different Wnt-inhibitors were compared: IWR1 (inhibitor of Wnt response) or IWP2 (inhibitor of Wnt production). We firstly found that the level of Troponin T (TNNT2) expression measured by FACS was significantly higher for both 2D protocols as compared to the 3D protocol. In the three methods, iPSC-CM show sarcomeric structures. However, iPSC-CM generated in 2D protocols constantly displayed larger sarcomere lengths as compared to the 3D protocol. In addition, mRNA and protein analyses reveal higher cTNi to ssTNi ratios in the 2D protocol using IWP2 as compared to both other protocols, indicating a higher sarcomeric maturation. Differentiation of cardiac myocytes with 2D monolayer-based protocols and the use of IWP2 allows the production of higher yield of cardiac myocytes that have more suitable characteristics to study sarcomeric cardiomyopathies

Functional Human Beige Adipocytes From Induced Pluripotent Stem Cells

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