Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis

Ustilago maydis is a ubiquitous pathogen of maize and a well-established model organism for the study of plant-microbe interactions. This basidiomycete fungus does not use aggressive virulence strategies to kill its host. U. maydis belongs to the group of biotrophic parasites (the smuts) that depend on living tissue for proliferation and development. Here we report the genome sequence for a member of this economically important group of biotrophic fungi. The 20.5-million-base U. maydis genome assembly contains 6,902 predicted protein-encoding genes and lacks pathogenicity signatures found in the genomes of aggressive pathogenic fungi, for example a battery of cell-wall-degrading enzymes. However, we detected unexpected genomic features responsible for the pathogenicity of this organism. Specifically, we found 12 clusters of genes encoding small secreted proteins with unknown function. A significant fraction of these genes exists in small gene families. Expression analysis showed that most of the genes contained in these clusters are regulated together and induced in infected tissue. Deletion of individual clusters altered the virulence of U. maydis in five cases, ranging from a complete lack of symptoms to hypervirulence. Despite years of research into the mechanism of pathogenicity in U. maydis, no 'true' virulence factors had been previously identified. Thus, the discovery of the secreted protein gene clusters and the functional demonstration of their decisive role in the infection process illuminate previously unknown mechanisms of pathogenicity operating in biotrophic fungi. Genomic analysis is, similarly, likely to open up new avenues for the discovery of virulence determinants in other pathogens. ©2006 Nature Publishing Group.J.K., M. B. and R.K. thank G. Sawers and U. Kämper for critical reading of the manuscript. The genome sequencing of Ustilago maydis strain 521 is part of the fungal genome initiative and was funded by National Human Genome Research Institute (USA) and BayerCropScience AG (Germany). F.B. was supported by a grant from the National Institutes of Health (USA). J.K. and R.K. thank the German Ministry of Education and Science (BMBF) for financing the DNA array setup and the Max Planck Society for their support of the manual genome annotation. F.B. was supported by a grant from the National Institutes of Health, B.J.S. was supported by the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada and the Canada Foundation for Innovation, J.W.K. received funding from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, J.R.-H. received funding from CONACYT, México, A.M.-M. was supported by a fellowship from the Humboldt Foundation, and L.M. was supported by an EU grant. Author Contributions All authors were involved in planning and executing the genome sequencing project. B.W.B., J.G., L.-J.M., E.W.M., D.D., C.M.W., J.B., S.Y., D.B.J., S.C., C.N., E.K., G.F., P.H.S., I.H.-H., M. Vaupel, H.V., T.S., J.M., D.P., C.S., A.G., F.C. and V. Vysotskaia contributed to the three independent sequencing projects; M.M., G.M., U.G., D.H., M.O. and H.-W.M. were responsible for gene model refinement, database design and database maintenance; G.M., J. Kämper, R.K., G.S., M. Feldbrügge, J.S., C.W.B., U.F., M.B., B.S., B.J.S., M.J.C., E.C.H.H., S.M., F.B., J.W.K., K.J.B., J. Klose, S.E.G., S.J.K., M.H.P., H.A.B.W., R.deV., H.J.D., J.R.-H., C.G.R.-P., L.O.-C., M.McC., K.S., J.P.-M., J.I.I., W.H., P.G., P.S.-A., M. Farman, J.E.S., R.S., J.M.G.-P., J.C.K., W.L. and D.H. were involved in functional annotation and interpretation; T.B., O.M., L.M., A.M.-M., D.G., K.M., N.R., V. Vincon, M. VraneŠ, M.S. and O.L. performed experiments. J. Kämper, R.K. and M.B. wrote and edited the paper with input from L.-J.M., J.G., F.B., J.W.K., B.J.S. and S.E.G. Individual contributions of authors can be found as Supplementary Notes

Characterization of bioactive fischerellins in the cyanobacterium fischerella spp.

The benthic, nitrogen-fixing cyanobacterium Fischerella spp. produces at least two bioactive substances called fischerellins. Both fischerellins, fischerellin A and B, show allelopathic action against other cyanobacteria and green algae. Previous observations existed about additional yet unidentified fischerellins in Fischerella spp..Aim of the first part of this study was to isolate and characterize additional fischerellins.In order to do this the isolation as well as the detection procedure of fischerellins had to be improved first. The detection by HPLC was amended by using Reversed-Phase-C18-separation. The removal of pigments disturbing the detection of fischerellins was achived by preseparating the methanolic crude extracts of Fischerella spp. over normal-phase-solid-phase extraction. Resulting from the improved analytical method a new fischerellin, named fischerellin C, could be isolated and its structure partly characterized. Fischerellin C exhibits a chromophore similar to the known fischerellins with typical absorption maxima in methanol at 263, 277, 295, 313 nm. The molecular weight determined by mass spectrometry is 297 m/z. Although very similar in its structure to fischerellin A and B, fischerellin C shows no allelopathic activity in agar diffusion tests against Anabaena sp. PCC 7120. Beside the new fischerellin C other fischerellins matching the UV/Vis absorption spectra of fischerellin A and B were observed at different retention times. This indicates either other substituted fischerellins or additional isomers.The second question addressed was how production of fischerellins is influenced by external conditions. In this study following abiotic conditions concerning media composition were varied. F. muscicola was cultured under nitrate or phosphate limitation. Further, different molybdenum and iron availability was tested on fischerellin production. However in none of the conducted experiments the fischerellin content nor the composition of different fischerellins showed clear dependance on varied concentrations. The variability in fischerellin content was even high in the same concentration levels. Despite often less biomass production with one exception no increased levels in fischerellins were found. Generally less fischerellins were found in the strongest iron and nitrogen limited cultures. This was interpreted as a result of the general impaired cell conditions seen by strongly decreased pigment content and less produced biomass. Although no dependance of fischerellin production on tested factors was found in this study influence of external factors on fischerellin production cannot be excluded

Charakterisierung von frühen Komponenten der Signaltransduktion in Ustilago maydis

In U. maydis ist die Zell-Zellerkennung über ein Pheromon-Rezeptor-System essentiell für die pathogene Entwicklung. Nach Pheromonstimulation werden ein cAMP-Signalweg und eine MAPK-Kaskade aktiviert, jedoch ist der genaue Mechanismus der Signalübermittlung von dem Pheromonrezeptor Pra ins Zellinnere unbekannt. In Analogie zu anderen Pilzen wurde postuliert, dass ein G-Protein als Signalübermittler fungiert. In U. maydis wurden vier Ga-Untereinheiten gpa1-gpa4 identifiziert, aber nur Gpa3 konnte bisher eine Funktion im cAMP-Signalweg zugeordnet werden. Es blieb ungeklärt, ob die restlichen Ga-Untereinheiten untereinander und zu Gpa3 funktionell redundant sind. In dieser Arbeit wurde der C-Terminus des Rezeptors Pra als wichtiger Bereich für die Signalweiterleitung identifiziert. Zellen, die ein C-terminal deletiertes Rezeptorprotein exprimieren, können nach Pheromonstimulation keine Konjugationshyphen ausbilden, sind jedoch noch in der Lage mit Wildtypzellen zu fusionieren und dikaryotische Filamente zu bilden. Dieser Defekt konnte auf eine fehlende Stimulation der MAPK-Kaskade eingegrenzt werden und deutet darauf hin, dass die MAPK-Kaskade über eine mit dem Pra1-C-Terminus interagierende Komponente aktiviert wird. Die funktionelle Redundanz der Ga-Untereinheiten wurde anhand von Stämmen untersucht, die nur Gpa3 oder keine funktionelle Ga-Untereinheit exprimieren. gpa1 gpa2 gpa4-Dreifachdeletionsmutanten zeigten eine wildtypartige Pheromonantwort und eine vollständige pathogene Entwicklung, jedoch reduzierte Sporenbildung. Die Ga-Untereinheiten Gpa1, Gpa2 und Gpa4 sind demnach im Lebenszyklus von U. maydis nicht essentiell. Ga-Nullmutanten zeigten phänotypisch keinen Unterschied zu gpa3-Einzeldeletionsmutanten und waren cAMP-revertierbar. In Bezug auf die Pheromonantwort wird demnach nur Gpa3 benötigt. Die cAMP-revertierbaren Phänotypen konnten auf die Appressorienbildung und Penetration erweitert werden. Dabei wurde erstmals die Bildung von „knospenden Filamenten" beschrieben, die auf der Pflanzenoberfläche und anderen hydrophoben Oberflächen auftritt. Die Pathogenität war durch cAMP-Zugabe nicht revertierbar, was zeigt, dass die Signalgebung durch Gpa3 für die Tumorentwicklung benötigt wird. Gpa3 ist somit die zentrale regulatorische Ga-Untereinheit im Lebenszyklus von U. maydis und funktionell nicht durch eine andere Ga-Untereinheit ersetzbar. Microarray-Analysen zeigten, dass in der Dreifachdeletionsmutante die Basalexpression weniger Gene der Pheromonantwort und des Metabolismus reduziert war, was die Pheromonantwort aber nicht beeinträchtigte. In der Transkriptomanalyse der gpa3-Deletionsmutante wurden insgesamt 163 im Vergleich zum Wildtypstamm differenziell exprimierte Gene identifiziert. Die Analyse dieser Gene ergab, dass Gpa3 den Nährstoffstatus der Zelle abbildet und an der Glucoserepression beteiligt ist. Das deutlich unterschiedliche Expressionsprofil im Vergleich zur Dreifachdeletionsmutante bestätigte die funktionell nicht-redundante Funktion von Gpa3

Charakterisierung von frühen Komponenten der Signaltransduktion in Ustilago maydis

In U. maydis ist die Zell-Zellerkennung über ein Pheromon-Rezeptor-System essentiell für die pathogene Entwicklung. Nach Pheromonstimulation werden ein cAMP-Signalweg und eine MAPK-Kaskade aktiviert, jedoch ist der genaue Mechanismus der Signalübermittlung von dem Pheromonrezeptor Pra ins Zellinnere unbekannt. In Analogie zu anderen Pilzen wurde postuliert, dass ein G-Protein als Signalübermittler fungiert. In U. maydis wurden vier Ga-Untereinheiten gpa1-gpa4 identifiziert, aber nur Gpa3 konnte bisher eine Funktion im cAMP-Signalweg zugeordnet werden. Es blieb ungeklärt, ob die restlichen Ga-Untereinheiten untereinander und zu Gpa3 funktionell redundant sind. In dieser Arbeit wurde der C-Terminus des Rezeptors Pra als wichtiger Bereich für die Signalweiterleitung identifiziert. Zellen, die ein C-terminal deletiertes Rezeptorprotein exprimieren, können nach Pheromonstimulation keine Konjugationshyphen ausbilden, sind jedoch noch in der Lage mit Wildtypzellen zu fusionieren und dikaryotische Filamente zu bilden. Dieser Defekt konnte auf eine fehlende Stimulation der MAPK-Kaskade eingegrenzt werden und deutet darauf hin, dass die MAPK-Kaskade über eine mit dem Pra1-C-Terminus interagierende Komponente aktiviert wird. Die funktionelle Redundanz der Ga-Untereinheiten wurde anhand von Stämmen untersucht, die nur Gpa3 oder keine funktionelle Ga-Untereinheit exprimieren. gpa1 gpa2 gpa4-Dreifachdeletionsmutanten zeigten eine wildtypartige Pheromonantwort und eine vollständige pathogene Entwicklung, jedoch reduzierte Sporenbildung. Die Ga-Untereinheiten Gpa1, Gpa2 und Gpa4 sind demnach im Lebenszyklus von U. maydis nicht essentiell. Ga-Nullmutanten zeigten phänotypisch keinen Unterschied zu gpa3-Einzeldeletionsmutanten und waren cAMP-revertierbar. In Bezug auf die Pheromonantwort wird demnach nur Gpa3 benötigt. Die cAMP-revertierbaren Phänotypen konnten auf die Appressorienbildung und Penetration erweitert werden. Dabei wurde erstmals die Bildung von „knospenden Filamenten" beschrieben, die auf der Pflanzenoberfläche und anderen hydrophoben Oberflächen auftritt. Die Pathogenität war durch cAMP-Zugabe nicht revertierbar, was zeigt, dass die Signalgebung durch Gpa3 für die Tumorentwicklung benötigt wird. Gpa3 ist somit die zentrale regulatorische Ga-Untereinheit im Lebenszyklus von U. maydis und funktionell nicht durch eine andere Ga-Untereinheit ersetzbar. Microarray-Analysen zeigten, dass in der Dreifachdeletionsmutante die Basalexpression weniger Gene der Pheromonantwort und des Metabolismus reduziert war, was die Pheromonantwort aber nicht beeinträchtigte. In der Transkriptomanalyse der gpa3-Deletionsmutante wurden insgesamt 163 im Vergleich zum Wildtypstamm differenziell exprimierte Gene identifiziert. Die Analyse dieser Gene ergab, dass Gpa3 den Nährstoffstatus der Zelle abbildet und an der Glucoserepression beteiligt ist. Das deutlich unterschiedliche Expressionsprofil im Vergleich zur Dreifachdeletionsmutante bestätigte die funktionell nicht-redundante Funktion von Gpa3