Funktionelle Charakterisierung von Doppeldeletionsmutanten des Bovinen Herpesvirus Typ 1 als Basis einer neuen Markervakzineformulierung

Ziel dieser Arbeit war es BoHV-1 Doppeldeletionsmutanten zu generieren, zu charakterisieren und bezüglich ihrer Vakzineeignung zu bewerten. Die vorgestellten Studien zur Charakterisierung eines gE und UL49.5 deletierten Virus (BoHV-1-DgEDUL49.5) konnten belegen, dass diese Deletionskombination als letal für BoHV-1 anzusehen ist. Ein UL49.5 deletiertes Virus verhielt sich dagegen funktionell wie ein Virus ohne UL49.5/gM-Komplex. Ähnlich wie bei anderen Alpha-Herpesviren war hier wahrscheinlich der zweite Umhüllungsschritt im Zytoplasma der infizierten Zelle gestört, so dass keine infektiöse Virusnachkommenschaft gebildet wurde. Ein Virus mit Deletionen der Genorte UL49 und gE (BoHV-1-DgEDUL49) zeigte hingegen fast keine Beeinträchtigungen im Hinblick auf die Replikationsfähigkeit. Dagegen war die Ausbreitungsmöglichkeit von Zelle-zu-Zelle (cell-to-cell-spread CTCS) einer solchen Mutante im Vergleich zu den entsprechenden einzel-deletierten Viren erheblich verringert. Da es sich hierbei um eine synergistische Verstärkung gegenüber den Einzelmutanten handelte, wurde geschlussfolgert, dass beide Proteine an derselben Funktionskette des CTCS beteiligt sind. Da die doppelt UL49 und gE deletierte Mutante allerdings weiterhin extrazelluläre, infektiöse Virusnachkommenschaften bildete, ist der CTCS als unabhängige Ausbreitungsform offensichtlich durch andere Funktionen bedingt als der klassische Weg der Virusausschleusung. Hinweise darauf, dass gE auch bei BoHV-1 mit pUL49 interagiert konnten dabei durch Kolokalisationsstudien im Laserscanmikroskop abgeleitet werden. Allerdings ließ keine dieser BoHV-1-Mutanten eine besondere Eignung als Vakzinestamm erkennen. Ein gE und TK doppelt deletiertes Virus zeigte hingegen in vitro kaum veränderte Wachstumseigenschaften verglichen mit dem einfach gEdeletierten Virus. Diese Deletionskombination sollte zudem gegenüber einer Virulenzsteigerung durch Rekombination mit Feldviren unempfindlicher sein, als die derzeit erhältlichen Lebendvakzinen. Zur Steigerung der immunogenen Wirkung des Lebendvirus wurde dieser neue Stamm (BoHV-1DgEDTK) in Kombination mit einem adjuvierenden, nicht viruziden, Blockpolymer eingesetzt. Dieser Ansatz wurde in einem Tierversuch an Kälbern im Vergleich zu der Immunisierung mit dem nicht adjuventierten Lebendvirus getestet. Im Ergebnis dieses Tierversuches schieden die Tiere, welche adjuventiert immunisiert wurden, weniger Virus und zudem für eine kürzere Zeit aus. Dies galt im Vergleich mit den nicht immunisierten Kontrolltieren wie auch im Vergleich mit den Tieren, die allein das Lebendvirus zur Immunisierung appliziert bekommen hatten. Auch die Quantifizierung der neutralisierenden Antikörper verdeutlichte eine gesteigerte Immunogenität der Kombination des doppelt deletierten Lebendvirus mit dem Adjuvants. Die sehr gute Immunitätslage der Tiere nach Impfung führte allerdings nach Belastungsinfektion auch zu einer zeitlich verzögerten Serokonversion im Markertest auf Basis des Nachweises von gE-spezifischen Antikörpern. Auch dies muss als Beleg für die hervorragende, immunisierende Leistung der neuen Präparation angesehen werden, da offensichtlich bei einigen der immunisierten Tiere die Virusreplikation soweit unterdrückt wird, dass keine gEspezifische Antikörperantwort mehr erfolgt. Die vorgestellte Kombination eines genetisch überattenuierten Lebendvirus und die Verstärkung der immunogenen Eigenschaften durch Zusatz eines nicht viruziden, potenten Adjuvants können die Grundlage für eine zukünftige Vakzinestratgie zur Bekämpfung der BoHV-1 oder anderer herpesviraler Infektionskrankheiten bilden

Migratory Status Is Not Related to the Susceptibility to HPAIV H5N1 in an Insectivorous Passerine Species

Migratory birds have evolved elaborate physiological adaptations to travelling, the implications for their susceptibility to avian influenza are however unknown. Three groups of stonechats (Saxicola torquata) from (I) strongly migrating, (II) weakly migrating and (III) non-migrating populations were experimentally infected with HPAIV H5N1. The different bird groups of this insectivorous passerine species were infected in autumn, when the migrating populations clearly exhibit migratory restlessness. Following infection, all animals succumbed to the disease from 3 through 7 days post inoculation. Viral shedding, antigen distribution in tissues, and survival time did not differ between the three populations. However, notably, endothelial tropism of the HPAIV infection was exclusively seen in the group of resident birds. In conclusion, our data document for the first time the high susceptibility of an insectivorous passerine species to H5N1 infection, and the epidemiological role of these passerine birds is probably limited due to their high sensitivity to HPAIV H5N1 infection. Despite pronounced inherited differences in migratory status, the groups were generally indistinguishable in their susceptibility, survival time, clinical symptoms and viral shedding. Nevertheless, the migratory status partly influenced pathogenesis in the way of viral tropism

Experimental Infection of Cattle with Highly Pathogenic Avian Influenza Virus (H5N1)

Four calves were experimentally inoculated with highly pathogenic avian influenza virus A/cat/Germany/R606/2006 (H5N1) isolated from a cat in 2006. All calves remained healthy, but several animals shed low amounts of virus, detected by inoculation of nasal swab fluid into embryonated chicken eggs and onto MDCK cells. All calves seroconverted

Pathogenicity of Highly Pathogenic Avian Influenza Virus (H5N1) in Adult Mute Swans

Adult, healthy mute swans were experimentally infected with highly pathogenic avian influenza virus A/Cygnus cygnus/Germany/R65/2006 subtype H5N1. Immunologically naive birds died, whereas animals with preexisting, naturally acquired avian influenza virus–specific antibodies became infected asymptomatically and shed virus. Adult mute swans are highly susceptible, excrete virus, and can be clinically protected by preexposure immunity

Limited Susceptibility of Chickens, Turkeys, and Mice to Pandemic (H1N1) 2009 Virus

To determine susceptibility of chickens, turkeys, and mice to pandemic (H1N1) 2009 virus, we conducted contact exposure and inoculation experiments. We demonstrated that chickens were refractory to infection. However, oculo-oronasally inoculated turkeys and intranasally inoculated mice seroconverted without clinical signs of infection

Highly Pathogenic Avian Influenza Virus Infection of Mallards with Homo- and Heterosubtypic Immunity Induced by Low Pathogenic Avian Influenza Viruses

The potential role of wild birds as carriers of highly pathogenic avian influenza virus (HPAIV) subtype H5N1 is still a matter of debate. Consecutive or simultaneous infections with different subtypes of influenza viruses of low pathogenicity (LPAIV) are very common in wild duck populations. To better understand the epidemiology and pathogenesis of HPAIV H5N1 infections in natural ecosystems, we investigated the influence of prior infection of mallards with homo- (H5N2) and heterosubtypic (H4N6) LPAIV on exposure to HPAIV H5N1. In mallards with homosubtypic immunity induced by LPAIV infection, clinical disease was absent and shedding of HPAIV from respiratory and intestinal tracts was grossly reduced compared to the heterosubtypic and control groups (mean GEC/100 µl at 3 dpi: 3.0×102 vs. 2.3×104 vs. 8.7×104; p<0.05). Heterosubtypic immunity induced by an H4N6 infection mediated a similar but less pronounced effect. We conclude that the epidemiology of HPAIV H5N1 in mallards and probably other aquatic wild bird species is massively influenced by interfering immunity induced by prior homo- and heterosubtypic LPAIV infections

Protection and Virus Shedding of Falcons Vaccinated against Highly Pathogenic Avian Influenza A Virus (H5N1)

Virus shedding by vaccinated birds was markedly reduced

Iota-Carrageenan Is a Potent Inhibitor of Influenza A Virus Infection

The 2009 flu pandemic and the appearance of oseltamivir-resistant H1N1 influenza strains highlight the need for treatment alternatives. One such option is the creation of a protective physical barrier in the nasal cavity. In vitro tests demonstrated that iota-carrageenan is a potent inhibitor of influenza A virus infection, most importantly also of pandemic H1N1/2009 in vitro. Consequently, we tested a commercially available nasal spray containing iota-carrageenan in an influenza A mouse infection model. Treatment of mice infected with a lethal dose of influenza A PR8/34 H1N1 virus with iota-carrageenan starting up to 48 hours post infection resulted in a strong protection of mice similar to mice treated with oseltamivir. Since alternative treatment options for influenza are rare, we conclude that the nasal spray containing iota-carrageenan is an alternative to neuraminidase inhibitors and should be tested for prevention and treatment of influenza A in clinical trials in humans

The UL49 gene product of BoHV-1: a major factor in efficient cell-to-cell spread

International audienceThe role of the UL49 gene product, VP22, of bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) in virus replication was characterized with respect to a putative functional interaction of VP22 with the viral glycoprotein E (gE) during BoHV-1 cell-to-cell spread. Deletion of the open reading frames of UL49 and/or gE from an infectious BoHV-1 bacterial artificial chromosome clone did not severely impair the production of viral progeny in single-step growth experiments. However, plaque sizes induced by a VP22-negative BoHV-1 were reduced by 52%, whilst for the gE/VP22-negative double-deletion mutant a reduction of 83% could be observed in comparison with parental and revertant viruses, which was consistent with a marked reduction in multi-step growth experiments at early time points. These results suggest that gE and VP22 are important for BoHV-1 cell-to-cell spread, and that both are likely to act independently of each other in a critical pathway for virus cell-to-cell spread