Influence of cGMP signaling on VSMC growth and its dependence on fibronectin in cultured VSMCs and development of atherosclerosis

Der im Jahr 1963 erstmals beschriebene sekundäre Botenstoff cyclisches Guanosin 3´ 5´-Monophosphat (cGMP) ist ein intrazelluläres Signalmolekül mit vielen Funktionen. Zu den bekanntesten physiologischen Wirkungen von cGMP gehört die Regulation des Blutflusses durch die Relaxation der vaskulären Glattmuskelzellen (VSMCs). cGMP-modulierende Medikamente werden bereits seit mehr als einem Jahrhundert für die Behandlung vasokonstriktiver Erkrankungen verwendet. In Säugetieren erfolgt die Bildung von cGMP entweder durch (1) cytosolische Stickstoffmonoxid (NO)-sensitive Guanylyl-Cyclasen (NO-GCs) oder durch (2) transmembrane “partikuläre“ Guanylyl-Cyclasen (pGCs). Letztere werden u.a. infolge der Bindung natriuretischer Peptide wie atriales natriuretisches Peptid (ANP) oder C-Typ natriuretisches Peptid (CNP) aktiviert. In VSMCs werden viele Effekte von cGMP durch die cGMP-abhängige Proteinkinase Typ I (cGKI) vermittelt. Neben der Regulation des Gefäßtonus sind VSMCs auch am vaskulären Umbau im Rahmen kardiovaskulärer Erkrankungen wie Atherosklerose und Restenose beteiligt. Unter physiologischen Bedingungen zeigen VSMCs meist einen kontraktilen Phänotyp. Bei pathophysiologischen Veränderungen wechseln VSMCs jedoch verstärkt in einen sog. synthetischen Phänotyp. Dieser unterscheidet sich vom kontraktilen Phänotyp durch eine gesteigerte Sekretion extrazellulärer Matrix (ECM)-Proteine, den Verlust kontraktiler Markerproteine, sowie eine erhöhte Proliferation. Ob eine Aktivierung des cGMP-Signalwegs den Vorgang der phänotypischen Modulation von VSMCs fördert oder inhibiert und somit die Entstehung vaskulärer Erkrankungen beschleunigt oder verlangsamt, wird kontrovers diskutiert. Bisherige Studien mit Knockout-Mausmodellen verschiedener Komponenten des cGMP-Signalweges weisen auf eine pro-atherosklerotische Wirkung des Signalweges in VSMCs hin. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der Effekt von cGMP auf das Wachstum von primären VSMCs untersucht. Anders als in vorhergehenden Wachstumsuntersuchungen, deren Ergebnisse auf konventionellen Endpunktmessungen (WST, MTS) beruhten, wurde in dieser Arbeit eine neue Impedanz-basierte Messtechnik mit der Bezeichnung xCELLigence verwendet. Diese Methode ermöglichte es, das Wachstumsverhalten von VSMCs in Echtzeit zu verfolgen und somit ein besseres Verständnis der Wachstumsregulation über den cGMP-Signalweg zu erhalten. Durch den Vergleich von Wildtyp-VSMCs mit NO-GC- und cGKI-defizienten VSMCs konnte gezeigt werden, dass NO (75 µM DETA-NO) das Wachstum von VSMCs durch die Aktivierung der NO-GC-cGMP-cGKI Signalkaskade stark beschleunigt. 2 In der verwendeten Konzentration hatte NO keinen signifikanten Einfluss auf die Vitalität der Zellen. Im Gegensatz zu NO bewirkte die Stimulation mit ANP nur eine moderate Erhöhung der Wachstumsrate, hatte aber einen stark positiven Effekt auf die Vitalität der VSMCs. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass es in VSMCs unterschiedliche cGMP-Kompartimente gibt, nämlich NO-induziertes globales cGMP und durch ANP ausgelöste lokale cGMP-Signale, welche unterschiedliche Effekte auf Zellwachstum und Vitalität vermitteln. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass der cGMP-induzierte Wachstumseffekt am stärksten ist, wenn die Aktivierung des cGMP-Signalwegs direkt bei der Aussaat der Zellen erfolgt. Diese Beobachtung lässt darauf schließen, dass cGMP vor allem in frühen Phasen des Wachstums, insbesondere beim adhärieren der Zellen, eine wichtige Funktion hat. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde analysiert, welchen Einfluss das ECM-Protein Fibronektin (Fn) auf das Wachstumsverhalten und die phänotypische Modulation von VSMCs ausübt und ob es evtl. mit dem cGMP-Signalweg in Verbindung steht. cGMP-Messungen mit dem FRET-basierten cGMP-Sensor cGi500 zeigten, dass in Gegenwart von Fn gewachsene VSMCs stärker auf CNP als auf ANP reagieren. Mittels Immunfluoreszenz-Färbungen konnte gezeigt werden, dass Zellen, die verstärkt auf CNP reagieren, eine reduzierte Expression kontraktiler Markerproteine (wie z.B. SMαA) haben und demzufolge einen eher synthetischen Phänotyp aufweisen. Schließlich wurde durch die Generierung eines Glattmuskel-spezifischen Fn Knockouts (Fn-smko) untersucht, inwiefern das Fn aus VSMCs die Entstehung von Atherosklerose beeinflusst. Interessanterweise wurde in VSMC-Kulturen aus Fn-smko Mäusen ein erhöhtes Zellwachstum beobachtet. Eine Western Blot-Analyse der Phosphorylierung von VASP (ein Indikator für die Aktivität von cGKI) sowie FRET-basierte cGMP-Messungen (Konzentrations-Wirkungs-Analyse von NO) wiesen darauf hin, dass VSMCs aus Fn-smko Mäusen eine erhöhte NO-GC Aktivität besitzen, was deren erhöhtes Zellwachstum erklären könnte. In Übereinstimmung mit den in vitro Daten zeigten in vivo Untersuchungen von Fn-smko Mäusen eine Zunahme atherosklerotischer Plaques. Diese Plaques waren im Vergleich zu Plaques aus der Fn-exprimierenden Kontrollgruppe durch eine höhere Stabilität (SMαA > Mac2 positive Fläche eines Plaques) gekennzeichnet. Zusammenfassend weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass die genetische Ablation von Fn in Glattmuskelzellen zu einer Amplifikation der wachstumsfördernden cGMP Signalkaskade in VSMCs führt, welche wiederum die Entwicklung stabiler atherosklerotischer Plaques mit einem hohen Anteil an VSMCs fördert

An unexpected gene cluster for downstream degradation of alkylphenols in Sphingomonas sp. strain TTNP3

In silico analysis of nucleotide sequences flanking the recently found hydroquinone dioxygenase in Sphingomonas sp. strain TTNP3 revealed a gene cluster that encodes a hydroquinone catabolic pathway. In addition to the two open-reading frames encoding the recently characterized hydroquinone dioxygenase, the cluster consisted of six open-reading frames. We were able to express the three open-reading frames, hqdC, hqdD, and hqdE, and demonstrated that the three gene products, HqdC, HqdD, and HqdE had 4-hydroxymuconic semialdehyde dehydrogenase, maleylacetate reductase, and intradiol dioxygenase activity, respectively. Surprisingly, the gene cluster showed similarities to functionally related clusters found in members of the β- and γ-proteobacteria rather than to those found in other members of the genus Sphingomonas sensu lat

Abstracts from the 8th International Conference on cGMP Generators, Effectors and Therapeutic Implications

This work was supported by a restricted research grant of Bayer AG

cGMP Signaling and Vascular Smooth Muscle Cell Plasticity

Cyclic GMP regulates multiple cell types and functions of the cardiovascular system. This review summarizes the effects of cGMP on the growth and survival of vascular smooth muscle cells (VSMCs), which display remarkable phenotypic plasticity during the development of vascular diseases, such as atherosclerosis. Recent studies have shown that VSMCs contribute to the development of atherosclerotic plaques by clonal expansion and transdifferentiation to macrophage-like cells. VSMCs express a variety of cGMP generators and effectors, including NO-sensitive guanylyl cyclase (NO-GC) and cGMP-dependent protein kinase type I (cGKI), respectively. According to the traditional view, cGMP inhibits VSMC proliferation, but this concept has been challenged by recent findings supporting a stimulatory effect of the NO-cGMP-cGKI axis on VSMC growth. Here, we summarize the relevant studies with a focus on VSMC growth regulation by the NO-cGMP-cGKI pathway in cultured VSMCs and mouse models of atherosclerosis, restenosis, and angiogenesis. We discuss potential reasons for inconsistent results, such as the use of genetic versus pharmacological approaches and primary versus subcultured cells. We also explore how modern methods for cGMP imaging and cell tracking could help to improve our understanding of cGMP’s role in vascular plasticity. We present a revised model proposing that cGMP promotes phenotypic switching of contractile VSMCs to VSMC-derived plaque cells in atherosclerotic lesions. Regulation of vascular remodeling by cGMP is not only an interesting new therapeutic strategy, but could also result in side effects of clinically used cGMP-elevating drugs

A Multiprotein DNA Translocation Complex Directs Intramycelial Plasmid Spreading during Streptomyces Conjugation

Conjugative DNA transfer in mycelial Streptomyces is a unique process involving the transfer of a double-stranded plasmid from the donor into the recipient and the subsequent spreading of the transferred plasmid within the recipient mycelium. This process is associated with growth retardation of the recipient and manifested by the formation of circular inhibition zones, named pocks. To characterize the unique Streptomyces DNA transfer machinery, we replaced each gene of the conjugative 12.1-kbp Streptomyces venezuelae plasmid pSVH1, with the exception of the rep gene required for plasmid replication, with a hexanucleotide sequence. Only deletion of traB, encoding the FtsK-like DNA translocase, affected efficiency of the transfer dramatically and abolished pock formation. Deletion of spdB3, spd79, or spdB2 had a minor effect on transfer but prevented pock formation and intramycelial plasmid spreading. Biochemical characterization of the encoded proteins revealed that the GntR-type regulator TraR recognizes a specific sequence upstream of spdB3, while Orf108, SpdB2, and TraR bind to peptidoglycan. SpdB2 promoted spheroplast formation by T7 lysozyme and formed pores in artificial membranes. Bacterial two-hybrid analyses and chemical cross-linking revealed that most of the pSVH1-encoded proteins interacted with each other, suggesting a multiprotein DNA translocation complex of TraB and Spd proteins which directs intramycelial plasmid spreading

Sildenafil Potentiates a cGMP-Dependent Pathway to Promote Melanoma Growth

SummarySildenafil, an inhibitor of the cGMP-degrading phosphodiesterase 5 that is used to treat erectile dysfunction, has been linked to an increased risk of melanoma. Here, we have examined the potential connection between cGMP-dependent signaling cascades and melanoma growth. Using a combination of biochemical assays and real-time monitoring of melanoma cells, we report a cGMP-dependent growth-promoting pathway in murine and human melanoma cells. We document that C-type natriuretic peptide (CNP), a ligand of the membrane-bound guanylate cyclase B, enhances the activity of cGMP-dependent protein kinase I (cGKI) in melanoma cells by increasing the intracellular levels of cGMP. Activation of this cGMP pathway promotes melanoma cell growth and migration in a p44/42 MAPK-dependent manner. Sildenafil treatment further increases intracellular cGMP concentrations, potentiating activation of this pathway. Collectively, our data identify this cGMP-cGKI pathway as the link between sildenafil usage and increased melanoma risk