Structural and Functional Characterization of a Lytic Polysaccharide Monooxygenase with Broad Substrate Specificity

The recently discovered lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) carry out oxidative cleavage of polysaccharides and are of major importance for efficient processing of biomass. NcLPMO9C from Neurospora crassa acts both on cellulose and on non-cellulose β-glucans, including cellodextrins and xyloglucan. The crystal structure of the catalytic domain of NcLPMO9C revealed an extended, highly polar substrate-binding surface well suited to interact with a variety of sugar substrates. The ability of NcLPMO9C to act on soluble substrates was exploited to study enzyme-substrate interactions. EPR studies demonstrated that the Cu2+ center environment is altered upon substrate binding, whereas isothermal titration calorimetry studies revealed binding affinities in the low micromolar range for polymeric substrates that are due in part to the presence of a carbohydrate-binding module (CBM1). Importantly, the novel structure of NcLPMO9C enabled a comparative study, revealing that the oxidative regioselectivity of LPMO9s (C1, C4, or both) correlates with distinct structural features of the copper coordination sphere. In strictly C1-oxidizing LPMO9s, access to the solvent-facing axial coordination position is restricted by a conserved tyrosine residue, whereas access to this same position seems unrestricted in C4-oxidizing LPMO9s. LPMO9s known to produce a mixture of C1- and C4-oxidized products show an intermediate situation

Institutions and Semantic Networks

61 σ.Παρουσιάζονται η θεωρίας των institutions καθώς και η έννοια του σημασιολογικού δικτύου και αποδεικνύεται ότι τα σημασιολογικά δίκτυα σχηματίζουν ένα institution.We present the theory of institutions and the concept of semantic network and prove that semantic networks form an institution.Μαρία Μ. Δημαρόγκων

Structural and functional study of biocatalysts implicated in hemicellulose degradation

The aim of the present PhD thesis was the biochemical and structural study of biocatalysts implicated in plant cell wall degradation. Two enzymes that belong to family glycoside hydrolase (GH) family 61 of CAZy (Carbohydrate-Active enZYmes) database were characterized biochemically while structural studies were carried out on a xylanase and a feruloyl esterase. FoCel61, a Fusarium oxysporum GH61 and StCel61, a Sporotrichum thermophile GH61 were cloned and heterologously expressed in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Their ability to hydrolyze a variety of polysaccharide substrates was subsequently investigated. Synergism experiments were performed by combining these enzymes with common cellulases and the resulting findings were correlated to the composition of the hydrolyzed material. It was found that both enzymes had the ability to increase the degree of lignocellulose conversion when combined with other cellulases and that this enhancing effect was dependent on the lignin content of the substrate. The structural characterization of two hemicellulases derived from F. oxysporum, a GH10 xylanase (FoXyn10a) and a type C feruloyl esterase (FoFaeC) was performed by X-ray crystallography. Diffracting crystals of both enzymes were grown under a variety of conditions. The structure of FoXyn10a was solved by molecular replacement using an homologous Cellumonas fimi xylanase as a starting model. FoXyn10a folds in the classical (8 barrel (TIM barrel) while the most striking difference observed, upon comparison with related GH10 structures, is the presence of an elongated loop above the catalytic cleft with possible functional role.Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη βιοκαταλυτών που εμπλέκονται στην αποικοδόμηση της φυτικής βιομάζας με τη βοήθεια εργαλείων μοριακής και δομικής βιολογίας. Πιο συγκεκριμένα, χαρακτηρίστηκαν βιοχημικά δύο πρωτεΐνες της οικογένειας 61 της βάσης δεδομένων CAZy (Carbohydrate-Active enZYmes Database) και μελετήθηκαν κρυσταλλογραφικά δύο ένζυμα η δράση των οποίων ήταν ήδη γνωστή, μία ξυλανάση και μία εστεράση του φερουλικού οξέος. Οι πρωτεΐνες της οικογενείας 61 που μελετήθηκαν προέρχονταν από τους μύκητες Fusarium oxysporum (FoCel61) και Sporotrichum thermophile (StCel61). Κλωνοποιήθηκαν και εκφράστηκαν μέσω της μεθυλότροφης ζύμης Pichia pastoris και χαρακτηρίστηκαν ως προς την ικανότητά τους να υδρολύουν μία ποικιλία σακχαρούχων υποστρωμάτων. Εξετάστηκε επίσης η συμβολή τους στην αποικοδόμηση της φυτικής βιομάζας παρουσία των κλασικών κυτταρινασών και συσχετίστηκε η παρατηρούμενη συνεργιστική δράση με τη σύσταση των χρησιμοποιούμενων υλικών. Βρέθηκε ότι τα ένζυμα αυτά έχουν την ικανότητα να αυξάνουν το βαθμό μετατροπής των λιγνινοκυτταρινούχων υποστρωμάτων όταν συνδυάζονται με τα γνωστά υδρολυτικά ένζυμα που χρησιμοποιούνται ευρέως στις διεργασίες αυτές και ότι η βελτίωση αυτή σχετίζεται με την περιεκτικότητα του υποστρώματος σε λιγνίνη. Η δομική μελέτη δύο ημικυτταρινασών που προέρχονται από το F. oxysporum, μίας ξυλανάσης της οικογένειας 10 (FoXyn10a) και μίας εστεράσης του φερουλικού οξέος τύπου C (FoFaeC) πραγματοποιήθηκε με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ. Κρύσταλλοι των δύο ενζύμων με ικανότητα περίθλασης των ακτίνων Χ αναπτύχθηκαν σε μία ποικιλία συνθηκών. Για τον προσδιορισμό της δομής της FoXyn10a εφαρμόστηκε η τεχνική της μοριακής αντικατάστασης χρησιμοποιώντας ως αρχικό μοντέλο τη δομή μίας ομόλογης ξυλανάσης από το Cellumonas fimi. Η καινούρια δομή ανέδειξε ότι η FoXyn10a υιοθετεί τη διαμόρφωση (β/α)8 barrel, μία αναδίπλωση κοινή σε όλα τα μέλη της οικογένειας 10, αλλά και την παρουσία ενός καινούριου βρόχου κοντά στην είσοδο του ενεργού κεντρού με πιθανό λειτουργικό ρόλο

Structural and Molecular Study of Biocatalysts implicated in Hemicellulose Degradation

163 σ.Τα τοιχώματα των φυτικών κυττάρων αποτελούν την πιο άφθονη πηγή οργανικού άνθρακα στη γη και η αξιοποίησή τους σε βιοτεχνολογικές εφαρμογές έχει προσελκύσει τα τελευταία χρόνια έντονο ερευνητικό ενδιαφέρον. Τα ένζυμα που συμβάλλουν στην αποικοδόμηση της φυτικής βιομάζας παρουσιάζουν μεγάλο ενδιαφέρον λόγω της εφαρμογής τους σε πληθώρα διεργασιών όπως είναι η βιομηχανία χάρτου, η αρτοποιία, η υφαντουργία, η παραγωγή ζωωτροφών και απορρυπαντικών και η παραγωγή βιοαιθανόλης δεύτερης γενιάς, χρησιμοποιώντας ως πρώτη ύλη κυτταρινούχα φυτά, αγροτικά ή δασικά παραπροϊόντα ή ακόμα και απορρίματα. Ειδικότερα, οι ερευνητικές προσπάθειες των τελευταίων ετών έχουν στραφεί στη μείωση του ενζυμικού φορτίου και κατά συνέπεια του κόστους που απαιτείται για τη μετατροπή της βιομάζας σε ζυμώσιμα σάκχαρα ώστε να είναι εφικτή και συμφέρουσα η παραγωγή βιοαιθανόλης σε βιομηχανικό επίπεδο. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη βιοκαταλυτών που εμπλέκονται στην αποικοδόμηση της φυτικής βιομάζας με τη βοήθεια εργαλείων μοριακής και δομικής βιολογίας. Πιο συγκεκριμένα, χαρακτηρίστηκαν βιοχημικά δύο πρωτεΐνες της οικογένειας 61 της βάσης δεδομένων CAZy (Carbohydrate-Active enZYmes Database) και μελετήθηκαν κρυσταλλογραφικά δύο ένζυμα η δράση των οποίων ήταν ήδη γνωστή, μία ξυλανάση και μία εστεράση του φερουλικού οξέος. Αρχικά γίνεται μία ανασκόπηση της σύστασης του φυτικού κυτταρικού τοιχώματος και των ενζύμων που συμβάλλουν στην αποικοδόμησή του. Τα ένζυμα αυτά έχουν κατηγοριοποιηθεί σε οικογένειες ανάλογα με την αμινοξική τους αλληλουχία. Αναλύονται ειδικότερα οι ιδιότητες και τα χαρακτηριστικά των ενζύμων που ανήκουν στις οικογένειες των γλυκοζιδικών υδρολασών 61 και 10 της CAZy και που μελετήθηκαν στo πλαίσιo της παρούσας εργασίας. Παρουσιάζεται επίσης η μέθοδος της κρυσταλλογραφίας ακτίνων Χ ως εργαλείο για τη δομική μελέτη των μακρομορίων. Οι πρωτεΐνες της οικογενείας 61 που μελετήθηκαν προέρχονταν από τους μύκητες Fusarium oxysporum (FoCel61) και Sporotrichum thermophile (StCel61). Κλωνοποιήθηκαν και εκφράστηκαν μέσω της μεθυλότροφης ζύμης Pichia pastoris και χαρακτηρίστηκαν ως προς την ικανότητά τους να υδρολύουν μία ποικιλία σακχαρούχων υποστρωμάτων. Εξετάστηκε επίσης η συμβολή τους στην αποικοδόμηση της φυτικής βιομάζας παρουσία των κλασικών κυτταρινασών και συσχετίστηκε η παρατηρούμενη συνεργιστική δράση με τη σύσταση των χρησιμοποιούμενων υλικών. Βρέθηκε ότι τα ένζυμα αυτά έχουν την ικανότητα να αυξάνουν το βαθμό μετατροπής των λιγνινοκυτταρινούχων υποστρωμάτων όταν συνδυάζονται με τα γνωστά υδρολυτικά ένζυμα που χρησιμοποιούνται ευρέως στις διεργασίες αυτές και ότι η βελτίωση αυτή σχετίζεται με την περιεκτικότητα του υποστρώματος σε λιγνίνη. Η δομική μελέτη δύο ημικυτταρινασών που προέρχονται από το F. oxysporum, μίας ξυλανάσης της οικογένειας 10 (FoXyn10a) και μίας εστεράσης του φερουλικού οξέος τύπου C (FoFaeC) πραγματοποιήθηκε με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ. Κρύσταλλοι των δύο ενζύμων με ικανότητα περίθλασης των ακτίνων Χ αναπτύχθηκαν σε μία ποικιλία συνθηκών. Για τον προσδιορισμό της δομής της FoXyn10a εφαρμόστηκε η τεχνική της μοριακής αντικατάστασης χρησιμοποιώντας ως αρχικό μοντέλο τη δομή μίας ομόλογης ξυλανάσης από το Cellumonas fimi. Η καινούρια δομή ανέδειξε ότι η FoXyn10a υιοθετεί τη διαμόρφωση (β/α)8 barrel, μία αναδίπλωση κοινή σε όλα τα μέλη της οικογένειας 10, αλλά και την παρουσία ενός καινούριου βρόχου κοντά στην είσοδο του ενεργού κεντρού με πιθανό λειτουργικό ρόλο.Plant cell walls are the most abundant source of organic carbon on the planet and their exploitation in biotechnological applications has attracted significant research interest. The enzymes implicated in plant biomass degradation are employed in a variety of industrial processes, ranging from paper, bread-making, textile, animal feed and detergent industry to the production of second generation bioethanol from cellulosic plants, agricultural and forestry byproducts or waste. Recent research efforts have focused on the reduction of protein loading required for the breakdown of lignocellulose to fermentable sugars, as the enzymic cost is currently the main obstacle of bioethanol production at industrial scale. The aim of the present PhD thesis was the biochemical and structural study of biocatalysts implicated in plant cell wall degradation. Two enzymes that belong to family glycoside hydrolase (GH) family 61 of CAZy (Carbohydrate-Active enZYmes) database were characterized biochemically while structural studies were carried out on a xylanase and a feruloyl esterase. In the first part of the thesis, the plant cell wall composition as well as the enzymes involved in its degradation are described. The latter have been divided into different families based on their amino acid sequence. The properties and characteristics of enzymes that belong to the GH families 61 and 10 of CAZy database are presented in more detail. The basic principles of X-ray crystallography, employed for the structural study of macromolecules, are also outlined. FoCel61, a Fusarium oxysporum GH61 and StCel61, a Sporotrichum thermophile GH61 were cloned and heterologously expressed in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Their ability to hydrolyze a variety of polysaccharide substrates was subsequently investigated. Synergism experiments were performed by combining these enzymes with common cellulases and the resulting findings were correlated to the composition of the hydrolyzed material. It was found that both enzymes had the ability to increase the degree of lignocellulose conversion when combined with other cellulases and that this enhancing effect was dependent on the lignin content of the substrate. The structural characterization of two hemicellulases derived from F. oxysporum, a GH10 xylanase (FoXyn10a) and a type C feruloyl esterase (FoFaeC) was performed by X-ray crystallography. Diffracting crystals of both enzymes were grown under a variety of conditions. The structure of FoXyn10a was solved by molecular replacement using an homologous Cellumonas fimi xylanase as a starting model. FoXyn10a folds in the classical (8 barrel (TIM barrel) while the most striking difference observed, upon comparison with related GH10 structures, is the presence of an elongated loop above the catalytic cleft with possible functional role.Μαρία Β. Δημαρόγκων

CELLULOSE DEGRADATION BY OXIDATIVE ENZYMES

Enzymatic degradation of plant biomass has attracted intensive research interest for the production of economically viable biofuels. Here we present an overview of the recent findings on biocatalysts implicated in the oxidative cleavage of cellulose, including polysaccharide monooxygenases (PMOs or LPMOs which stands for lytic PMOs), cellobiose dehydrogenases (CDHs) and members of carbohydrate-binding module family 33 (CBM33). PMOs, a novel class of enzymes previously termed GH61s, boost the efficiency of common cellulases resulting in increased hydrolysis yields while lowering the protein loading needed. They act on the crystalline part of cellulose by generating oxidized and non-oxidized chain ends. An external electron donor is required for boosting the activity of PMOs. We discuss recent findings concerning their mechanism of action and identify issues and questions to be addressed in the future

Lignin boosts the cellulase performance of a GH-61 enzyme from Sporotrichum thermophile

An enzyme belonging to the glycoside hydrolase family 61 from the thermophilic fungus Sporotrichum thermophile, was functionally expressed in the methylotrophic yeast Pichia pastoris under the transcriptional control of the alcohol oxidase (AOX1) promoter. The enzyme hydrolyzed barley beta-glucan, carboxymethyl cellulose, lichenan, wheat arabinoxylan and birchwood xylan showing optimal activity at pH 8 and 65 degrees C. A 2:1 mixture of Celluclast 1.5 L and StCel61a was capable of increasing the degree of spruce conversion by 42%. The use of substrates with varying lignin content permitted the detection of a dependence of the enhancing capacity of StCel61a on the radical scavenging capacity of the different lignocellulosics. In the presence of a reductant, StCel61a boosted the efficiency of a mixture of purified cellulases (EGII, CBHI, beta-GLUC) by 20%. The synergistic activity exhibited by StCel61a and its dependence on reducing substances provide guidelines for process design towards the production of economically viable bioethanol

Marine-derived biocatalysts: Importance, accessing, and application in aromatic pollutant bioremediation

The aim of the present review is to highlight the potential use of marine biocatalysts (whole cells or enzymes) as an alternative bioprocess for the degradation of aromatic pollutants. Firstly, information about the characteristics of the still underexplored marine environment and the available scientific tools used to access novel marine-derived biocatalysts is provided. Marine-derived enzymes, such as dioxygenases and dehalogenases, and the involved catalytic mechanisms for the degradation of aromatic and halogenated compounds, are presented, with the purpose of underpinning their potential use in bioremediation. Emphasis is given on persistent organic pollutants (POPs) that are organic compounds with significant impact on health and environment due to their resistance in degradation. POPs bioaccumulate mainly in the fatty tissue of living organisms, therefore current efforts are mostly focused on the restriction of their use and production, since their removal is still unclear. A brief description of the guidelines and criteria that render a pollutant POP is given, as well as their potential biodegradation by marine microorganisms by surveying recent developments in this rather unexplored field. © 2017 Nikolaivits, Dimarogona, Fokialakis and Topakas