Modification des gels de mucus par la délivrance de molécules composées de domaines CYS

Mucus is a gel conserved among vertebrates and invertebrates. Its major functions arethe protection and hydration of non-keratinized epithelia. Gel-forming mucins are multidomainproteins, which self-associate together to form linear and entangled polymers toform the mucus glycoprotein matrix. The well-characterized covalent interactions, but alsonon-covalent (reversible) links, are responsible for the viscoelastic character of mucus. Themucin CYS domain is found in mucus on the surface of all secretory human mucosae. Itis very well conserved in vertebrates and very hydrophobic. Thus, it is one of the bestcandidates for establishing reversible hydrophobic bonds.The aim of this work is to study the impact of CYS domain enrichment on propertiesof mucus gels. For this, a transgenic mouse model (Tg222) and a mucus-secretingcell line (HT29-MTX E12), constitutively secreting a recombinant molecule made of 12consecutive CYS domains (rCYSx12), were developed. The effect of endogenous deliveryof rCYSx12 on mucus gel permeability, cellular motility and rheological properties wasstudied (micro- and macro-scale). Cellular models secreting a molecule made up of CYSdomains (poly-CYS) have also been developed in order to consider the exogenous deliveryof this molecule, and to study its effect in a pathological context.Endogenous delivery of rCYSx12 into the mucus of the HT29-MTX E12 cell linedecreased the permeability of the mucus gel. The secretion of rCYSx12 was also associatedwith a decrease in bacterial motility (velocity and linearity of displacement) in the mucusof the cellular and mouse models. The rheological properties of the colonic mucus weredetermined at multi-scale levels. The delivery of rCYSx12 leads to a remodeling of the mucus protein matrix by reducing its mesh size. The production of a poly-CYS moleculewas developed in the yeast Pichia pastoris and in the human cell line HEK293. UnlikeP. pastoris, the HEK293 cell line produced and secreted the poly-CYS molecule withoutapparent modifications.The rCYSx12 is of great therapeutic interest for strengthening mucus gels in pathologicalcontexts such as ulcerative colitis or intrauterine infections. The development ofmodels stably secreting the poly-CYS molecule will make it possible to carry out exogenousdelivery tests, and thus to evaluate the therapeutic potential of this molecule.Le mucus est un gel conservé chez les vertébrés et les invertébrés. Ses fonctions majeures sont la protection et l’hydratation des épithéliums non kératinisés. Les mucines gélifiantes sont des protéines multi-domaines qui s’associent en polymères linéaires et enchevêtrés pour former la matrice glycoprotéique du mucus. Les interactions covalentes bien caractérisées des mucines, mais aussi les associations non covalentes (réversibles),sont responsables du caractère viscoélastique du mucus. Le domaine CYS des mucines est retrouvé dans le mucus à la surface de toutes les muqueuses sécrétoires humaines. Il est très conservé chez les vertébrés et très hydrophobe. De ce fait, il est l’un des meilleur scandidats pour l’établissement de liaisons hydrophobes réversibles.L’objectif de ce travail est d’étudier l’impact d’un enrichissement en domaine CYS sur les propriétés des gels de mucus. Pour cela, un modèle murin transgénique (Tg222) e tune lignée cellulaire muco-sécrétante (HT29-MTX E12), sécrétant constitutivement une molécule recombinante composée de 12 domaines CYS consécutifs (rCYSx12), ont été développés. L’effet de la délivrance endogène de rCYSx12 sur la perméabilité du gel de mucus, la motilité cellulaire et les propriétés rhéologiques du gel ont été étudiés. Des modèles cellulaires sécrétant des molécules constituées de domaines CYS (poly-CYS) ont aussi été développés afin d’envisager la délivrance exogène de cette molécule, et d’étudier son effet dans un contexte pathologique.La délivrance endogène de rCYSx12 dans le mucus de la lignée cellulaireHT29-MTX E12 diminue la perméabilité du gel de mucus. La sécrétion de rCYSx12est également associée à une diminution de la motilité bactérienne (vitesse et linéarité du déplacement) dans les mucus des modèles cellulaire et murin. Les propriétés rhéologiques du mucus colique murin ont été déterminées à plusieurs échelles. La délivrance derCYSx12 entraîne un remodelage de la matrice protéique du mucus en réduisant la taille des mailles que forment les mucines gélifiantes. La production d’une molécule poly-CYS aété développée chez la levure Pichia pastoris et dans la lignée cellulaire d’origine humaineHEK293. Contrairement à P. pastoris, la lignée HEK293 produit et sécrète la molécule poly-CYS sans modifications importantes apparentes.La molécule rCYSx12 revêt un grand intérêt thérapeutique pour renforcer les gels de mucus dans des contextes pathologiques, comme la rectocolite hémorragique ou les infections intra-utérines. Le développement de modèles sécrétant stablement une molécule poly-CYS permettra de réaliser des tests de délivrance exogène, et ainsi déterminer le potentiel thérapeutique de cette molécule

Mucus gel modifications through the delivery of molecules made up of CYS domains

Le mucus est un gel conservé chez les vertébrés et les invertébrés. Ses fonctions majeures sont la protection et l’hydratation des épithéliums non kératinisés. Les mucines gélifiantes sont des protéines multi-domaines qui s’associent en polymères linéaires et enchevêtrés pour former la matrice glycoprotéique du mucus. Les interactions covalentes bien caractérisées des mucines, mais aussi les associations non covalentes (réversibles),sont responsables du caractère viscoélastique du mucus. Le domaine CYS des mucines est retrouvé dans le mucus à la surface de toutes les muqueuses sécrétoires humaines. Il est très conservé chez les vertébrés et très hydrophobe. De ce fait, il est l’un des meilleur scandidats pour l’établissement de liaisons hydrophobes réversibles.L’objectif de ce travail est d’étudier l’impact d’un enrichissement en domaine CYS sur les propriétés des gels de mucus. Pour cela, un modèle murin transgénique (Tg222) e tune lignée cellulaire muco-sécrétante (HT29-MTX E12), sécrétant constitutivement une molécule recombinante composée de 12 domaines CYS consécutifs (rCYSx12), ont été développés. L’effet de la délivrance endogène de rCYSx12 sur la perméabilité du gel de mucus, la motilité cellulaire et les propriétés rhéologiques du gel ont été étudiés. Des modèles cellulaires sécrétant des molécules constituées de domaines CYS (poly-CYS) ont aussi été développés afin d’envisager la délivrance exogène de cette molécule, et d’étudier son effet dans un contexte pathologique.La délivrance endogène de rCYSx12 dans le mucus de la lignée cellulaireHT29-MTX E12 diminue la perméabilité du gel de mucus. La sécrétion de rCYSx12est également associée à une diminution de la motilité bactérienne (vitesse et linéarité du déplacement) dans les mucus des modèles cellulaire et murin. Les propriétés rhéologiques du mucus colique murin ont été déterminées à plusieurs échelles. La délivrance derCYSx12 entraîne un remodelage de la matrice protéique du mucus en réduisant la taille des mailles que forment les mucines gélifiantes. La production d’une molécule poly-CYS aété développée chez la levure Pichia pastoris et dans la lignée cellulaire d’origine humaineHEK293. Contrairement à P. pastoris, la lignée HEK293 produit et sécrète la molécule poly-CYS sans modifications importantes apparentes.La molécule rCYSx12 revêt un grand intérêt thérapeutique pour renforcer les gels de mucus dans des contextes pathologiques, comme la rectocolite hémorragique ou les infections intra-utérines. Le développement de modèles sécrétant stablement une molécule poly-CYS permettra de réaliser des tests de délivrance exogène, et ainsi déterminer le potentiel thérapeutique de cette molécule.Mucus is a gel conserved among vertebrates and invertebrates. Its major functions arethe protection and hydration of non-keratinized epithelia. Gel-forming mucins are multidomainproteins, which self-associate together to form linear and entangled polymers toform the mucus glycoprotein matrix. The well-characterized covalent interactions, but alsonon-covalent (reversible) links, are responsible for the viscoelastic character of mucus. Themucin CYS domain is found in mucus on the surface of all secretory human mucosae. Itis very well conserved in vertebrates and very hydrophobic. Thus, it is one of the bestcandidates for establishing reversible hydrophobic bonds.The aim of this work is to study the impact of CYS domain enrichment on propertiesof mucus gels. For this, a transgenic mouse model (Tg222) and a mucus-secretingcell line (HT29-MTX E12), constitutively secreting a recombinant molecule made of 12consecutive CYS domains (rCYSx12), were developed. The effect of endogenous deliveryof rCYSx12 on mucus gel permeability, cellular motility and rheological properties wasstudied (micro- and macro-scale). Cellular models secreting a molecule made up of CYSdomains (poly-CYS) have also been developed in order to consider the exogenous deliveryof this molecule, and to study its effect in a pathological context.Endogenous delivery of rCYSx12 into the mucus of the HT29-MTX E12 cell linedecreased the permeability of the mucus gel. The secretion of rCYSx12 was also associatedwith a decrease in bacterial motility (velocity and linearity of displacement) in the mucusof the cellular and mouse models. The rheological properties of the colonic mucus weredetermined at multi-scale levels. The delivery of rCYSx12 leads to a remodeling of the mucus protein matrix by reducing its mesh size. The production of a poly-CYS moleculewas developed in the yeast Pichia pastoris and in the human cell line HEK293. UnlikeP. pastoris, the HEK293 cell line produced and secreted the poly-CYS molecule withoutapparent modifications.The rCYSx12 is of great therapeutic interest for strengthening mucus gels in pathologicalcontexts such as ulcerative colitis or intrauterine infections. The development ofmodels stably secreting the poly-CYS molecule will make it possible to carry out exogenousdelivery tests, and thus to evaluate the therapeutic potential of this molecule

Non-C-mannosylable mucin CYS domains hindered proper folding and secretion of mucin

International audienceThe CYS domain occurs in multiple copies in many gel-forming mucins. It is believed that CYS domains can interact with each other in a reversible manner, suggesting a key role of the domain in gel formation. This domain always contains in its amino-terminal sequence the C-mannosylation motif WXXW, but whether the CYS domain is C-mannosylated is debated, and the putative role of C-mannosylation of the domain is unclear. We prepared recombinant CYS domains of the human mucin MUC5B with (WXXW→AXXW) and without a single amino acid mutation and mini-5B mucins made of a large Ser/Thr/Pro region flanked by two CYS domains with the WXXW motif or with the mutated AXXW motif on the first, second or both CYS domains. We found that the single CYS domain and the two CYS domains of mini-5B mucin must be C-mannosylable for the efficient maturation and secretion of the recombinant molecules; otherwise, they are retained in the cell and co-localized with a resident enzyme of the endoplasmic reticulum

Mucin CYS domain stiffens the mucus gel hindering bacteria and spermatozoa.

Mucus is the first biological barrier encountered by particles and pathogenic bacteria at the surface of secretory epithelia. The viscoelasticity of mucus is governed in part by low energy interactions that are difficult to assess. The CYS domain is a good candidate to support low energy interactions between GFMs and/or mucus constituents. Our aim was to stiffen the mucus from HT29-MTX cell cocultures and the colon of mice through the delivery of a recombinant protein made of hydrophobic CYS domains and found in multiple copies in polymeric mucins. The ability of the delivery of a poly-CYS molecule to stiffen mucus gels was assessed by probing cellular motility and particle diffusion. We demonstrated that poly-CYS enrichment decreases mucus permeability and hinders displacement of pathogenic flagellated bacteria and spermatozoa. Particle tracking microrheology showed a decrease of mucus diffusivity. The empirical obstruction scaling model evidenced a decrease of mesh size for mouse mucus enriched with poly-CYS molecules. Our data bring evidence that enrichment with a protein made of CYS domains stiffens the mucin network to provide a more impermeable and protective mucus barrier than mucus without such enrichment

La structure des mucines conditionne les propriétés viscoélastiques des gels de mucus

Le mucus représente la première ligne de défense innée chez les mammifères. Les mucines gélifiantes qui le constituent forment un réseau protéique au sein duquel coexistent des régions hydrophiles et hydrophobes. Il est maintenu par des interactions covalentes et réversibles qui définissent les propriétés rhéologiques du gel. Cette revue décrit la structure et les fonctions du mucus en se focalisant sur les interactions protéine-protéine, ou interactome, des mucines gélifiantes. Du fait de leur nature réversible et de leur dépendance vis-à-vis de l’environnement physico-chimique, le rôle des interactions de faible énergie n’est pas totalement compris. Cependant, ce type de liaisons constitue une cible thérapeutique prometteuse pour contrebalancer les anormalités du mucus observées dans les pathologies associées aux muqueuses