RUOLO DELLE INTEGRINE LEUCOCITARIE NELL'ADESIONE E NELL'ATTIVAZIONE METABOLICA DEI LEUCOCITI POLIMORFONUCLEATI NEUTROFILI UMANI STIMOLATI CON IL FATTORE DI NECROSI TUMORALE

1997/1998La matrice extracellulare (MEC) è in grado di modulare diverse funzioni cellulari, quali la proliferazione, la differenziazione, la chemiotassi, la produzione di citochine, ecc .. Per quanto riguarda i leucociti polimorfonucleati neutroftli (PMN), si è visto che queste cellule rispondono al fattore di necrosi tumorale (TNF) con una consistente e sostenuta produzione di 02- (burst respiratorio) solo se poste a contatto con determinate proteine della MEC. Nel nostro laboratorio è stato dimostrato, ad esempio, che PMN incubati con TNF su superfici rivestite con fibronectina (FN) aderiscono a questo substrato e vanno incontro ad attivazione del metabolismo ossidativo, mentre su superfici rivestite con altre proteine della matrice, come la laminina (LM), rispondono alla citochina con un aumento di adesione, ma non con l'attivazione metabolica. Pertanto, affmchè i PMN producano 02- quando stimolati con il TNF, sembra essere indispensabile un particolare tipo di interazione adesiva di queste cellule con la matrice. I recettori che mediano l'adesione delle cellule alla MEC sono le integrine, glicoproteine transmembranarie abbondantemente espresse anche dai PMN. In particolare, i neutroftli espongono in superficie soprattutto integrine appartenenti alle sottofamiglie ~~ e ~2; entrambi i tipi di molecole si sono dimostrati capaci di riconoscere la FN e di mediare quindi l'adesione dei PMN a questa proteina di matrice, che risulta permissiva ai fmi del burst indotto dal TNF. Gli studi condotti hanno permesso di dimostrare che sol~ le integrine ~2 sono coinvolte nella risposta adesiva e ossidati va al TNF da parte dei PMN sulla FN. Dati di letteratura indicano che, delle tre integrine ~2 espresse dai PMN ( aL~2, aM~2, ax~2), solo aL~2 e ax~2 sono in grado di mediare di per sé (cioè in assenza di stimoli solubili) una produzione di 0 2- da parte dei PMN; è pertanto legittimo pensare che l'attivazione metabolica di queste cellule indotta dal TNF sulla FN, sia riferibile a questi due tipi di integrine. Bisogna sottolineare tuttavia che: l. la diversa attitudine delle tre integrine ~2 a trasdurre il segnale per la produzione di 02- è stata stabilita esclusivamente per le molecole costitutivamente espresse sui PMN; l 2. la funzionalità delle integrine può venir modificata da agenti "attivanti" come è il caso del TNF; 3. questa citochina, oltre a fungere da attivatore delle integrine, agisce anche da secretagogo e le fa quindi iperesprimere; 4. le integrine che vengono traslocate sulla plasmamembrana in seguito a stimolazione dei PMN da parte di agenti degranulanti possono esibire caratteristiche funzionali diverse rispetto alle integrine espresse costitutivamente. N o n si può allora escludere che, in condizioni di stimo lazio ne, altri tipi di integrine acquisiscano la competenza a trasdurre alla cellula il segnale per l'attivazione metabolica. Lo scopo di questa tesi è stato pertanto di individuare la/le integrine ~2 direttamente responsabili della produzione di 0 2- da parte dei PMN stimolati con TNF sulla FN. Inizialmente abbiamo cercato di stabilire in che misura aL~2, aM~2 e ax~2 fossero coinvolte nell'adesione, indotta da TNF, dei neutro fili a questa proteina della MEC. L'approccio sperimentale consisteva nell'impedire selettivamente l'interazione di ciascun tipo di integrina ~2 con la FN, mediante l'utilizzo di anticorpi monoclonali diretti contro le diverse catene a. V aiutando le conseguenti modificazioni della risposta adesiva dei PMN al TNF, si è potuto stabilire che: l. l' integrina aL~2 è poco o per nulla coinvolta nel mediare l'adesione TNF-dipendente dei neutro fili alla FN; infatti, il numero di PMN aderenti al substrato non veniva alterato in maniera significativa dall'anticorpo an ti aL; inoltre, aggiungendo al mezzo di incubazione la miscela di anticorpi anti aM e anti ax (condizione in cui aL~2 rimane l'unica integrina ~2 in grado di interagire con la FN), l'adesione dei PMN stimolati con TNF era riportata a valori basali. 2. l'adesione alla FN dei neutro fili stimolati con TNF è sostenuta essenzialmente da aM~2 e, in misura minore, da ax~2; l'utilizzo dei mAb specifici determinava infatti una significativa inibizione del numero di cellule adese. Andando poi a valutare le conseguenze del "knock out" selettivo delle varie integrine ~2 sulla risposta metabolica dei PMN al TNF, sembrava che tutti e tre i tipi di molecole fossero coinvolti nella produzione di 0 2- sulla FN (i relativi mAb anti a inibivano significativamente, seppure in misura diversa, la risposta ossidativa). Poichè l'attivazione metabolica dei neutrofili indotta dal TNF è strettamente adesione-dipendente, era però importante veri- 2 ficare se il ruolo di ciascuna integrina nel burst fosse diretto o indiretto; si trattava cioè di capire, per ognuna di esse, se fosse in grado di trasdurre alla cellula il segnale per la produzione di 02- o se contribuisse alla risposta ossidativa semplicemente garantendo l'adesione dei PMN alla FN. Il problema non sussisteva, ovviamente, per aL~ 2 che era già risultata estranea al fenomeno prettamente adesivo, ma riguardava piuttosto le altre due integrine, sicuramente coinvolte nell'aggancio PMN-FN. Per ottenere una prova diretta della capacità delle singole integrine ~2 di mediare il segnale per l'attivazione metabolica, ci siamo avvalsi di un altro modello sperimentale: i PMN venivano stimolati con TNF su superfici rivestite con mAb anti a, in un mezzo di incubazione privo di Ca2+/Mg 2+. Ciò permetteva di ottenere il crosslinking selettivo dell'integrina d'interesse attraverso il riconoscimento specifico antigene (integrina)-anticorpo e, nel contempo, di prevenire qualsiasi risposta aspecifica dovuta al contatto degli altri due tipi di molecole con il substrato; infatti, l'assenza di ioni divalenti compromette la capacità pro adesiva delle integrine ~ 2 ed annulla di conseguenza la produzione di 02- indotta da TNF. E' stato così possibile accertare che, "catturando" i PMN attraverso aL~2 si ha una produzione di 02- sovrapponibile a quella ottenuta dal crosslinking indiscriminato di tutte le integrine ~2 (PMN incubati con TNF su un mAb diretto contro la catena ~2 comune); invece, "catturando" le cellule attraverso aM~ 2 o ax~2 la quantità di 02- prodotta non è superiore a quella ottenuta sul mAb di controllo (anti HLA-A, B, C). Le risposte ossidative registrate sui mAb anti aL e anti ~2 si sono dimostrate assolutamente specifiche, in quanto inibibili dal relativo anticorpo solubile aggiunto al mezzo di incubazione, ma non dal mAb di controllo. Complessivamente, grazie a questo approccio sperimentale abbiamo potuto confermare il ruolo diretto di aL~2 nella risposta metabolica dei PMN al TNF ed escluderlo invece sia per aM~2 che per ax~2, integrine a cui va attribuito comunque il ruolo fondamentale di garantire un efficace contatto neutro filo- FN. Il modello dei mAb immobilizzati è stato inoltre utile per approfondire la conoscenza del meccanismo d'azione del TNF nell'indurre la risposta metabolica attraverso le integrine, in particolare per indagare sul contributo del citoscheletro nel fenomeno studiato. Avevamo infatti osservato che i PMN trattati con TNF sulle superfici rivestite con anticorpi anti aL o anti ~2, pur rispondendo con una cospicua produzione di 0 2-, non assumevano assoluta- 3 mente la morfologia spread che, per quanto fmora noto, è indispensabile al burst metabolico indotto dal TNF. Pertanto, per stabilire in che misura il riassemblaggio del citoscheletro fosse responsabile della risposta ossidativa sui mAb immobilizzati, abbiamo voluto verificare quanto essa fosse sensibile alla citocalasina B (CB), inibitore della polimerizzazione dell'actina, e alla genisteina, inibito re di tiro sin chinasi coinvolte nell'aggancio delle integrine al citoscheletro. Dai risultati ottenuti con questo tipo di esperimenti risulta evidente che CB e genisteina inibiscono solo parzialmente la risposta metabolica al TNF sul mAb anti aL, lasciando nel contempo inalterato il numero di cellule catturate dall'anticorpo immobilizzato. Ciò indica che, in una condizione sperimentale in cui la presenza di mAb specifici garantisce l'aggancio ottimale dell'integrina trasduttrice del segnale per l'attivazione metabolica, l'azione stimolatoria del TNF è in buona parte svincolata dalla polimerizzazione del citoscheletro; in condizioni fisiologiche, al contrario, il riassemblaggio citoscheletrico risulta indispensabile e si può ipotizzare che abbia la funzione di consentire un'appropriata interazione aLPz-substrato. Il ruolo del TNF nell'attivazione metabolica non si può comunque ridurre a quello di semplice induttore di un'adesione che consente l'efficiente impegno di aLPz; dal confronto dei dati ottenuti, nel modello dei mAb immobilizzati, con cellule a riposo e stimolate con la citochina, è emerso che aLp2, costitutivamente capace di segnalare per la produzione di Oz-, potenzia la sua attività nei PMN stimolati con TNF. Ciò non è d'altra parte attribuibile ad una modificazione quantitativa delle integrine coinvolte, dal momento che aLPz non è iperesprimibile (il numero di cellule "catturate" dal mAb specifico è infatti lo stesso sia in condizioni resting che di stimolazione); i risultati ottenuti suggeriscono pertanto che il TNF esalti la funzione trasduttrice di aLp2, inducendo una modificazione strutturale dell'integrina attraverso un meccanismo di segnalazione inside-out.X Ciclo1968Versione digitalizzata della tesi di dottorato cartacea

Complex Coacervates between a Lactose-Modified Chitosan and Hyaluronic Acid as Radical-Scavenging Drug Carriers

Complex coacervation of two oppositely charged polysaccharides, namely a lactose-modified chitosan (CTL) and hyaluronan (HA), was investigated in this study. Coacervates of the two polysaccharides were prepared by drop-by-drop injection of HA into CTL. Transmittance and dynamic light scattering (DLS) measurements in combination with TEM analyses demonstrated the formation of spheroidal colloids in the nano-/microsize range showing good homogeneity. Strikingly, the presence of 150 mM supporting NaCl did not hamper the colloid formation. Stability studies on selected formulations demonstrated that HA/CTL coacervates were stable up to 3 weeks at 37 \ub0C and behaved as pH-responsive colloids since transition from entangled to disentangled chains was attained for a proper pH range. The possibility of freeze-drying the coacervates for storage purposes and the ability of encapsulating selected payloads were investigated as well, for two values of the fraction of the lactitol side-chain substitution (FL). Finally, biological tests using human neutrophils were undertaken at acidic pH value (pH = 6.0): under such experimental conditions, akin to those frequently occurring in the inflammatory microenvironment, coacervates scavenged reactive oxygen species (ROS) generated by these cells in basal conditions. Given the well documented bioactivity of CTL with respect to chitosan toward cartilage regeneration, these findings point to a possible application of HA/CTL-based colloids as scavenging and bioactive carriers for the delivery of therapeutic molecules at confined inflamed sites such as knee joints

A novel point mutation in the CYBB gene promoter leading to a rare X minus chronic granulomatous disease variant — Impact on the microbicidal activity of neutrophils

AbstractThis article reports an atypical and extremely rare case of X-linked CGD in an Italian family characterized by a low expression of gp91phox (X91− CGD). A novel point mutation in the CYBB gene's promoter (insertion of a T at position −54T to −56T) appeared to prevent the full expression of this gene in the patient's neutrophils and correlated with a residual oxidase activity in the whole cells population. The expression and functional activity of the oxidase in eosinophils appeared to be almost normal. Gel shift assays indicated that the mutation led to decreased interactions with DNA-binding proteins. The total O2− production in the patient's granulocytes (5–7% of normal) supported no microbicidal power after 45 min and 60 min of contact with S. aureus and C. albicans, respectively. Despite this residual oxidase activity, the patients suffered from severe and life-threatening infections. It was concluded that in these X91− CGD neutrophils, the O2− production per se was not sufficient to protect the patient against severe infections

Chloride movements in human neutrophils during phagocytosis: Characterization and Relationship to Granule Release

Chloride ion efflux is an early event occurring after exposure of human neutrophils to several soluble agonists. Under these circumstances, a rapid and reversible fall in the high basal intracellular chloride (Cl\u2013i) levels is observed. This event is thought to play a crucial role in the modulation of several critical neutrophil responses including activation and up-regulation of adhesion molecules, cell attachment and spreading, cytoplasmic alkalinization, and activation of the respiratory burst. At present, however, no data are available on chloride ion movements during neutrophil phagocytosis. In this study, we provide evidence that phagocytosis of Candida albicans opsonized with either whole serum, complement-derived opsonins, or purified human IgG elicits an early and long-lasting Cl\u2013 efflux accompanied by a marked, irreversible loss of Cl\u2013i. Simultaneous assessment of Cl\u2013 efflux and phagocytosis in cytochalasin D-treated neutrophils indicated that Cl\u2013 efflux occurs without particle ingestion. These results suggest that engagement of immune receptors is sufficient to promote chloride ion movements. Several structurally unrelated chloride channel blockers inhibited phagocytosis-induced Cl\u2013 efflux as well as the release of azurophilic\u2014but not specific\u2014granules. It implicates that different neutrophil secretory compartments display distinct sensitivity to Cl\u2013i modifications. Intriguingly, inhibitors of Cl\u2013 exchange inhibited cytosolic Ca2+ elevation, whereas Cl\u2013 efflux was not impaired in Ca2+-depleted neutrophils. We also show that Fc\u3b3R(s)- and CR3/CR1-mediated Cl\u2013 efflux appears to be dependent on protein tyrosine phosphorylation but independent of PI3K and phospholipase C activation

Intracellular shunting of O2 12 contributes to charge compensation and preservation of neutrophil respiratory burst in the absence of voltage-gated proton channel activity

Proton efflux via voltage-gated proton channels (Hv1) is considered to mediate the charge compensation necessary to preserve NADPH oxidase activity during the respiratory burst. Using the Hv1 inhibitor Zn(2+), we found that the PMA-induced respiratory burst of human neutrophils is inhibited when assessed as extracellular production of O2(-) and H2O2, in accordance with literature studies, but, surprisingly, unaffected when measured as oxygen consumption or total (extracellular plus intracellular) H2O2 production. Furthermore, we show that inhibiting Hv1 with Zn(2+) results in an increased production of intracellular ROS. Similar results, i.e. decreased extracellular and increased intracellular ROS production, were obtained using a human granulocyte-like cell line with severely impaired Hv1 expression. Acidic extracellular pH, which dampens proton efflux, also augmented intracellular production of H2O2. Zinc caused an increase in the rate but not in the extent of depolarization and cytosolic acidification indicating that mechanisms other than proton efflux take part in charge compensation. Our results suggest a hitherto unpredicted mechanism of charge compensation whereby, in the absence of proton efflux, part of O2(-) generated within gp91(phox) in the plasma membrane is shunted intracellularly down electrochemical gradient to dampen excessive depolarization. This would preserve NADPH oxidase activity under conditions such as the inflammatory exudate in which the acidic pH hinders charge compensation by proton efflux

Chitosan Acetylation Degree Influences the Physical Properties of Polysaccharide Nanoparticles: Implication for the Innate Immune Cells Response

The aim of the present contribution is twofold as it reports (i) on the role played by chitosan acetylation degree for the stability of nanoparticles (NPs) formed with hyaluronan and (ii) on the effect of the interaction of such NPs with immune cells. Chitosans with similar viscosity-average molecular weight, Mv, (i.e., 200 000) and different fractions of acetylated units (F A ) together with low-molecular-weight hyaluronan were chosen for developing a select library of formulations via electrostatic complex coacervation. The resulting NPs were analyzed in terms of size, polydispersity, surface charge, and stability in physiological-mimicked media by dynamic light scattering. Only medium acetylated chitosan (F A = 0.16) guaranteed the stability of NPs. To explore the effect of NPs interaction with immune cells, the release of proinflammatory cytokines and the reactive oxygen species production by human macrophages and neutrophils, respectively, were evaluated. Strikingly, a structure-function relationship emerged, showing that NPs made of chitosans with F A = 0.02, 0.25, 0.46, and 0.63 manifested a proinflammatory activity, linked to the instability of the system. Conversely, NPs made of chitosan with F A = 0.16 neither modified the functional response of macrophages nor that of neutrophils. Of note, such NPs were found to possess additional properties potentially advantageous in applications such as delivery of therapeutics to target inflamed sites: (i) they are devoid of cytotoxic effects, (ii) they avoid engulfment during the early stage of interaction with macrophages, and (iii) they are muco-adhesive, thereby providing for site-specificity and long-residence effect

Novel NOD2 Mutation in Early-Onset Inflammatory Bowel Phenotype

BACKGROUND: Nucleotide-binding oligomerization domain 2 (NOD2) is a key intracellular protein of the innate immune system. NOD2 variants are associated with inflammatory bowel disease (IBD) and other inflammatory phenotypes. We described the case of a baby with a very early-onset IBD who is characterized by a rare homozygous variant in NOD2, found through whole-exome sequencing, Its pathogenic effect was investigated through bioinformatics and functional studies. METHODS: The microbicide activity of the patient's phagocytes was analyzed using Escherichia coli. HEK293 and Caco2 cell lines were transfected with wild-type and mutated NOD2 cDNA to evaluate the NF-kB activity and the protein distribution. The functionality of the NOD2 pathway was assessed through analysis of the expression of tumor nectrosis factor alpha (TNF\u3b1) on monocytes. The levels of various cytokines were quantified in the patient plasma by a multiplex suspension array. RESULTS: A missense NOD2 mutation, c.G1277A; p.R426H in homozygosis, was found. The patient's microbicide activity was comparable to that observed in controls. HEK293 cells transfected with the mutated cDNA showed a 20-fold increase of NF-kB activation in basal condition. Moreover, Caco2 immunostaining revealed a different cytoplasmic distribution of the mutated protein compared with wild-type. A higher production of TNF\u3b1 by monocytes and elevated levels of plasmatic cytokines and chemokines were evidenced in the patient. CONCLUSIONS: This homozygous mutation is functionally relevant and shows a different NOD2 involvement in the IBD phenotype. In our patient, this mutation caused a gain of function typical of the Blau syndrome phenotype, manifesting, however, an IBD-like phenotype