Plastidial Starch Phosphorylase in Sweet Potato Roots Is Proteolytically Modified by Protein-Protein Interaction with the 20S Proteasome

Post-translational regulation plays an important role in cellular metabolism. Earlier studies showed that the activity of plastidial starch phosphorylase (Pho1) may be regulated by proteolytic modification. During the purification of Pho1 from sweet potato roots, we observed an unknown high molecular weight complex (HX) showing Pho1 activity. The two-dimensional gel electrophoresis, mass spectrometry, and reverse immunoprecipitation analyses showed that HX is composed of Pho1 and the 20S proteasome. Incubating sweet potato roots at 45°C triggers a stepwise degradation of Pho1; however, the degradation process can be partially inhibited by specific proteasome inhibitor MG132. The proteolytically modified Pho1 displays a lower binding affinity toward glucose 1-phosphate and a reduced starch-synthesizing activity. This study suggests that the 20S proteasome interacts with Pho1 and is involved in the regulation of the catalytic activity of Pho1 in sweet potato roots under heat stress conditions

Implication des enzymes de débranchement dans la biosynthèse de l'amylopectine

L'implication des enzymes de débranchement, tout particulièrement de l'isoamylase, dans la biosynthèse de l'amylopectine semble désormais acquise. Une mutation au locus sta7 de l'algue verte unicellulaire chlamydomonas reinhardtii entraîne un arrêt total de la synthèse d'amidon et l'apparition d'un polysaccharide soluble hyperbranché : le phytoglycogène. A l'instar des végétaux supérieurs, la présence de phytoglycogène laisse présager la défectuosite d'une enzyme de débranchement. Dans ce travail, nous déterminons dans un premier temps quelles sont les enzymes responsables de la production du phytoglycogène. La découverte d'un nouveau locus (STA8) nous ouvre une nouvelle voie vers la compréhension du rôle de l'isoamylase dans la biosynthèse de l'amylopectine. Ce locus, lorsqu'il est muté, provoque non pas la disparition (comme c'est le cas chez le mutant sta7) mais une réduction de l'activité de l'enzyme. Ceci a pour conséquence une diminution de la quantité d'amidon accumulée avec encore une fois apparition concomitante de phytoglycogène. Cette diminution d'activité n'explique pas a elle seule le phénotype observé. Les analyses génétiques et biochimiques detaillées des deux mutations sta7 et sta8 révèlent la présence d'un complexe enzymatique de haute masse responsable de l'activité isoamylasique chez Chlamydomonas. La mutation sta8 entraîne un défaut d'architecture de ce complexe qui reste malgré tout actif alors que la mutation sta7 provoque sa disparition. La structure du complexe isoamylasique s'avère donc être un facteur déterminant pour la biosynthèse correcte de l'amylopectine.LILLE1-BU (590092102) / SudocSudocFranceF

Établissement de l'implication des a- et b-amylases et des a-glucanes phosphorylases au cours de la dégradation de l'amidon dans la feuille d'Arabidopsis thaliana

Différentes classes d enzymes hydrolytiques (a- et b-amylases) et phosphorolytiques (amidon-phosphorylases) des a-glucanes sont impliquées dans le métabolisme de l amidon dans la feuille d Arabidopsis thaliana. Pas moins de 9 b-amylases, 3 a-amylases et 2 glucane-phosphorylases ont été répertoriées dans le génome de cette plante. Afin de leur attribuer une fonction précise, une étude phénotypique complète de lignées mutantes pour les formes plastidiales de ces enzymes a été menée au cours de ce travail. Chaque isoforme d amylase a également été croisée avec un double mutant d enzymes de branchement, be2- be3-, qui est totalement dépourvu d amidon et accumule du maltose de manière inhabituelle. Afin de préciser l implication de chaque forme d amylase pour la production de ce maltose, le contenu en maltose des triples mutants a été analysé. Nos résultats nous permettent de conforter l hypothèse d une fonction de régulation de BAM4. Les perturbations observées dans les mutants bam1- et bam8- montrent l importance de ces enzymes dans le métabolisme de l amidon. Enfin, les résultats obtenus avec le mutant aam3- ne nous révèlent rien de sa fonction. L analyse de l a-glucane phosphorylase plastidiale PHS1 a été couplée à celle du mutant ss4- (une forme d amidon synthétase soluble) et du double mutant ss4- phs1-. En effet, on observe au sein de ce double mutant des grains d une taille 4 à 5 fois supérieure à ceux de la souche sauvage ainsi qu une très forte augmentation de la quantité d amidon. Les résultats nous indiquent que PHS1 est impliquée dans la dégradation de l amidon, n attaquant pas le grain natif, et qu elle est similaire à ses homologues des plantes supérieures.Different classes of a-glucans hydrolytic (a- and b-amylases) and phosphorolytic enzymes are implicated in starch metabolism in Arabidopsis thaliana leaves. At least, 9 b-amylases, 3 a-amylases and 2 a-glucan phosphorylases are listed in this plant genome. In order to allocate them a precise function, a complete phenotypic study of mutant lines for plastidial forms of these enzymes was investigated. Each isoform of amylase studied was crossed with a double mutant of branching enzymes, be2- be3-, wich is free of starch and accumulating maltose which is unusual in this plant. In order to specify the implication of each form of amylase for the production of maltose in the be2- be3- mutant, maltose content of the triple mutants was analyzed. Our results allow us to strengthen the hypothesis of a regulating function of BAM4. Alterations observed in mutants bam1- and bam8- show us importance of these enzymes in starch metabolism. Finally, results obtained from analysis of aam3- mutant don t reveal anything about its function. Analysis of plastidial a-glucan phosphorylase PHS1 was coupled with that of the mutant ss4- (a form of soluble starch synthase) and the double mutant ss4- phs1-. In fact, in this double mutant we observed starch granules 4 to 5 fold bigger than those of the wild-type strain and a strong increase of starch content. Results obtained show that PHS1 is implicated in starch degradation, don t breaking native granule directly, and that it is similar to phosphorylases of land plants.LILLE1-Bib. Electronique (590099901) / SudocSudocFranceF

Étude du métabolisme de l'amidon floridéen (dissection moléculaire et fonctionnelle chez l'algue cryptophyte Guillardia theta et la dinoflagellée hétérotrophe Crypthecodinium cohnii)

L'endosymbiose primaire, événement à l'origine des eucaryotes photosynthétiques, a donné naissance à plusieurs groupes d'espèces qui accumulent une nouvelle forme de polysaccharide de réserve cristallin : l'amidon. Du fait de leur impact économique fort, les plantes vertes sont devenues le modèle par excellence pour étudier la biosynthèse de l'amidon plastidial. Ecrasées par leurs sœurs, l'étude de la synthèse de l'amidon cytoplasmique (dit floridéen) des algues rouges est restée très marginale. Les données disponibles à ce jour ébauchent ce qui semble être un métabolisme radicalement différent de celui des plantes. Afin d'approcher ce métabolisme alternatif, nous nous sommes proposés d'établir des modèles d'études biochimiques, moléculaires et génétiques dans la lignée des algues rouges. Les espèces choisies sont l'algue cryptophyte Guillardia theta et la dinoflagellée Crypthècodinium cohnii. Ces eucaryotes photosynthétiques sont nés de l'acquisition d'un plaste par un protiste hétérotrophe au cours d'une endosymbiose secondaire impliquant une algue rouge. Crypthecodinium cohnii a particulièrement été choisie car, contrairement à l'ensemble des algues rouges, elle présente quasiment toutes les caractéristiques requises à l'élaboration d'un modèle d'études fonctionnelles. Ce manuscrit de thèse présente le décryptage d'une partie de la voie de biosynthèse de l'amidon floridéen chez les deux espèces choisies. Il décrit également la mise au point d'outils de génétique et de marqueurs de sélection permettant d'approfondir l'étude fonctionnelle de la biosynthèse de l'amidon floridéen chez Crypthecodinium cohnii.LILLE1-BU (590092102) / SudocSudocFranceF

Mutants of Arabidopsis Lacking Starch Branching Enzyme II Substitute Plastidial Starch Synthesis by Cytoplasmic Maltose Accumulation

Three genes, BE1, BE2, and BE3, which potentially encode isoforms of starch branching enzymes, have been found in the genome of Arabidopsis thaliana. Although no impact on starch structure was observed in null be1 mutants, modifications in amylopectin structure analogous to those of other branching enzyme II mutants were detected in be2 and be3. No impact on starch content was found in any of the single mutant lines. Moreover, three double mutant combinations were produced (be1 be2, be1 be3, and be2 be3), and the impact of the mutations on starch content and structure was analyzed. Our results suggest that BE1 has no apparent function for the synthesis of starch in the leaves, as both be1 be2 and be1 be3 double mutants display the same phenotype as be2 and be3 separately. However, starch synthesis was abolished in be2 be3, while high levels of α-maltose were assayed in the cytosol. This result indicates that the functions of both BE2 and BE3, which belong to class II starch branching enzymes, are largely redundant in Arabidopsis. Moreover, we demonstrate that maltose accumulation depends on the presence of an active ADP-glucose pyrophosphorylase and that the cytosolic transglucosidase DISPROPORTIONATING ENZYME2, required for maltose metabolization, is specific for β-maltose

LIKE EARLY STARVATION 1 interacts with amylopectin during starch biosynthesis

International audienceStarch is the major energy storage compound in plants. Both transient starch and long-lasting storage starch accumulate in the form of insoluble, partly crystalline granules. The structure of these granules is related to the structure of the branched polymer amylopectin: linear chains of glucose units organized in double helices that align to form semicrystalline lamellae, with branching points located in amorphous regions between them. EARLY STARVATION 1 (ESV1) and LIKE EARLY STARVATION 1 (LESV) proteins are involved in the maintenance of starch granule structure and in the phase transition of amylopectin, respectively, in Arabidopsis (Arabidopsis thaliana). These proteins contain a conserved tryptophan-rich C-terminal domain folded into an antiparallel β-sheet, likely responsible for binding of the proteins to starch, and different N-terminal domains whose structure and function are unknown. In this work, we combined biochemical and biophysical approaches to analyze the structures of LESV and ESV1 and their interactions with the different starch polyglucans. We determined that both proteins interact with amylopectin but not with amylose and that only LESV is capable of interacting with amylopectin during starch biosynthesis. While the C-terminal domain interacts with amylopectin in its semicrystalline form, the N-terminal domain of LESV undergoes induced conformational changes that are probably involved in its specific function of mediating glucan phase transition. These results clarify the specific mechanism of action of these 2 proteins in the biosynthesis of starch granules