High-Throughput miRNA and mRNA Sequencing of Paired Colorectal Normal, Tumor and Metastasis Tissues and Bioinformatic Modeling of miRNA-1 Therapeutic Applications

MiRNAs are discussed as diagnostic and therapeutic molecules. However, effective miRNA drug treatments with miRNAs are, so far, hampered by the complexity of the miRNA networks. To identify potential miRNA drugs in colorectal cancer, we profiled miRNA and mRNA expression in matching normal, tumor and metastasis tissues of eight patients by Illumina sequencing. We validated six miRNAs in a large tissue screen containing 16 additional tumor entities and identified miRNA-1, miRNA-129, miRNA-497 and miRNA-215 as constantly de-regulated within the majority of cancers. Of these, we investigated miRNA-1 as representative in a systems-biology simulation of cellular cancer models implemented in PyBioS and assessed the effects of depletion as well as overexpression in terms of miRNA-1 as a potential treatment option. In this system, miRNA-1 treatment reverted the disease phenotype with different effectiveness among the patients. Scoring the gene expression changes obtained through mRNA-Seq from the same patients we show that the combination of deep sequencing and systems biological modeling can help to identify patient-specific responses to miRNA treatments. We present this data as guideline for future pre-clinical assessments of new and personalized therapeutic options

The use of Photodynamic Therapy in Dentistry. Clinical and experimental studies

0. Titelblatt Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 1 2. Problemstellung 12 3\. Material und Methode 18 3.1 Material 18 3.2 Methode 34 4 Ergebnisse 52 4.1 Spektralphotometrische Untersuchungen 52 4.2 Penetrationsmessungen mit dem Axiophot-Mikroskop 53 4.3 Transmissionsmessungen mit dem UMSP 54 4.4 Ergebnisse der PDT 60 5 Diskussion 76 5.1 Material 76 5.2 Methoden 86 5.3 Vergleich eigener Ergebnisse mit der Literatur 99 6 Schlussfolgerung 108 7 Zusammenfassung 110 Literaturverzeichnis Klinische Falldarstellungen 144 Ergänzende Tabellen 170 Danksagung 198Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Photodynamischen Therapie (PDT) als Alternative zu den herkömmlichen Verfahren für die Therapie benigner Mundschleimhautläsionen. Dies betrifft sowohl die häufigste Mundschleimhautläsion, die rezidivierende benigne Aphthosis (RBA), als auch weiße Mundschleimhautveränderungen, wie zum Beispiel die Leukoplakie und der orale Lichen planus, die eine Vorstufe von malignen Tumoren, insbesondere dem Plattenepithelkarzinom, darstellen können. Bei der Leukoplakie und dem oralen Lichen planus ist aufgrund der Rezidive und des Entartungsrisikos bei konventioneller Behandlungsmethode eine dauerhafte Nachkontrolle erforderlich. Andererseits sind die RBA meist therapieresistent, und nur eine symptomatische, aber keine Kausaltherapie ist möglich. Der Einsatz einer alternativen, verbesserten Behandlungsmethode ist deshalb wünschenswert. Die Anwendung der PDT zur kurativen Behandlung oberflächlicher Hauttumoren und zur palliativen Behandlung disseminierter bösartiger Haut- und Mundschleimhautläsionen ist bekannt. Die PDT basiert auf einem photochemischen Prozess, bei dem Photosensibilisatoren (PS) mittels Laserstrahlung aktiviert werden und zytotoxisch wirken. Die klinische Anwendung der PDT ist möglich, wenn erkranktes Gewebe solche Substanzen selektiv aufnimmt. In diesem Fall kann durch systemische Verabreichung der Substanzen und topische Lichtapplikation eine selektive Zerstörung des erkrankten Gewebes unter Erhalt des Normalgewebes gelingen. Neben der systemischen Applikation ist auch eine topische Applikation an der Mundschleimhaut möglich. Eine Auswahl von Farbstoffen (TB-O, MB) welche besonders gut zur Detektion von malignen Veränderungen geeignet sind und deren photodynamische Aktivität bekannt ist, wurden zunächst hinsichtlich ihrer Photostabilität (Photobleichen) und ihrer Penetration an der Mundschleimhaut untersucht. Es wurden die photophysikalischen Eigenschaften (Veränderung der Absorption nach Bestrahlung bzw. Photobleaching, O2-Generierung) und die penetrationskinetischen Eigenschaften dieser Farbstoffe evaluiert. Anschließend wurden die beiden Farbstoffe bezogen auf Patienten mit weißen und entzündlichen Mundschleimhautveränderungen untersucht. Durch die Abstimmung von Farbstoffen und Lichtquellen wurden in den vorliegenden Untersuchungen die Vorteile und Nachteile der lokalen PDT analysiert und die Bedeutung dieser Verfahren beurteilt. Anhand der Ergebnissen der spektralphotometrischen Untersuchungen von TB-O und MB mit und ohne Bestrahlungen erfolgte eine annähernd lineare Abnahme der Extinktion bei TB-O und MB mit Zunahme der applizierten Energiedichte. Die Untersuchungen an normaler Mundschleimhaut zeigten auch, dass die sichtbare Penetration von MB und TB-O nur auf die ersten 1-2 äußeren Zelllagen des Epithels begrenzt war. Bei Vergleich der Penetrationstiefe von MB und TB-O in Condylomata accuminata erreichten MB und TB-O weitaus höhere Penetrationstiefen (130-180 mm)) als in den homogenen Leukoplakien. Während des dreijährigen Untersuchungszeitraumes konnte bei Läsionen von 5 Patienten mit Lichen planus eine deutliche Verbesserung der Symptome, aber keine vollständige Heilung erzielt werden. Es konnte nach TB-O- und MB-PDT eine vollständige Rückbildung von 5 Läsionen bei 3 Patienten beobachtet werden. Bei den anderen Läsionen wurde eine Regression gesehen. Die noch verbliebenen Restbefunde der Leukoplakien wurden abschließend entweder mit einer 5-ALA-PDT behandelt oder mit CO2-Laser vaporisiert. Für Patienten mit RBA war eine Energiedichte von 42-79 J/cm2 genügend. Sowohl für die Leukoplakien als auch für den Lichen planus musste mehr als die doppelte Energiedichte appliziert (72-178 J/cm2) werden, um eine Wirkung zu erzielen. Mit den neuen Applikatoren wie z. B dem 3600-Applikator ist es möglich, eine gleichmäßige Dosis auch in den hinteren Bereichen der Mundhöhle zu realisieren. Durch den Einsatz der photodynamischen Therapie konnte in dieser Untersuchung bei Aphthen eine rasch eintretende Schmerzfreiheit und eine beschleunigte Wundheilung beobachtet werden. Andererseits ist die PDT-Behandlung der Leukoplakie der klassisch- und laserchirurgischen Entfernung unterlegen. Ferner war mittels PDT nur eine Verbesserung der Schmerzen bei der Lichen planus möglich. Weitere Studien mit größeren Patientenkollektiven und längerem Behandlungszeitraum sollte durchgeführt werden, um die PDT als alternatives Therapieverfahren für benigne Mundschleimhauterkrankungen zu validieren.Aim of this study was to investigate some possibilities of Photodynamic Therapy (PDT) as an alternative treatment to current treatment strategies for benign lesions of the mouth. That regards recurrent benign aphthosis (RBA) as well as ?white? lesions of the mouth e.g leukoplakia and oral lichen planus. Both of these ?white? lesions present a tendency to a malignant transformation. All the current therapeutic methods represent a high recurrency rate and most of them side effects. Aphthosis is a painful disease and only symptomatic therapy is generally applied. Therefore search for an alternative treatment method is mandatory. The use of (PDT) for the curative treatment of superficial tumors of the skin and for the palliative treatment of disseminated tumors of the skin and the oral mucosa is well known. PDT is based on a photochemical process, where Photosenbilisators (PS) act cytotoxic by generation of 1O2 after laser irradiation. For the clinical use of PDT the abnormal tissues selectively should absorb these substances that after systemical or local application after irradiation with a certain light dose, the tissues will be destroyed and simlultaneously the normal tissues should be maintained. Toluidine blue-O and Methylenblue(MB) have proven both, antibacterial and photodynamic activity (potency to generate 1O2). These substances are already used for the detection of malignant changes of the mucosa by topical application. These substances were studied regarding their photostability (change of their absorption after irradiation, Photobleaching) and their penetration into the oral mucosa. In the clinical investigation both substances we applied to patients with leukoplakias, oral lichen planus and recurrent benign aphthosis. Photosensibilisation was achieved with MB, TB-O, ALA, a topical precursor of PPIX, well known in superficial topical PDT. The results of the spectralphotometric studies for TB-O and MB with and without irradiation showed a linear decline of the Extinktion of TB-O and MB with increase of the applied Energy. The penetration studies on normal mucosa showed that a visible penetration of MB and TB-O was restricted to the 1-2 first cell layers. The penetrationdepth for MB and TB-O was higher for Condylomata acuminata (130-180 mm)as for homogeous leukoplakias. During the three years , 14 patients with leukoplakias, 5 with oral lichen panus and 7 with recurrent benign aphthosis were treated with PDT. Irradiation was performed either with a flashlamp pumped dyes laser or a quasi-cw dye laser at 633nm with applicators appropriate for the region (microlens, 1800, 3600 isotropic applicator). Some patients if the lesions could not be removed by PDT had additional CO2-laser treatment .Of the 5 patients with oral lichen planus, a noticeable improvement of symptoms but not a complete healing of the lesions has been noticed. The leukoplakia lesions treated with TB-O/MB showed a gradual improvement with no side effects, but required up to 5 treatments. In the treatment of leukoplakias side effects were common with ALA, all patients reported burning sensation during irradiation, and a subsequent period of swelling of up to 4 days.TB-O/MB-PDT offer a new therapeutic strategy for recurrent benign aphthosis. It also shows a preventive component: all patients had experienced more frequent recurrences prior to PDT than after. The antibacterial effect of TB-O/MB may be responsible for this. On the other hand, PDT of leukoplakias is more time consuming compared to the established treatments and show no clear benefits regarding side effects and long time results. For the 7 patients with RBA was an Energy density of 42-79 J/cm2genügend. For the effective treatment of the 14 patients with leukoplakias as for the 5 patients with oral lichen planus more as the double Energydensity had to be applied (72-178 J/cm2). With the neu Applicators was eine homogenous irradiation possible. More studies with larger number of patients and longer treatmentstime are needed to evaluate PDT as an alternative treatment method

Multi-omic profiles of human non-alcoholic fatty liver disease tissue highlight heterogenic phenotypes

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a consequence of sedentary life style and high fat diets with an estimated prevalence of about 30% in western countries. It is associated with insulin resistance, obesity, glucose intolerance and drug toxicity. Additionally, polymorphisms within, e.g., APOC3, PNPLA3, NCAN, TM6SF2 and PPP1R3B, correlate with NAFLD. Several studies have already investigated later stages of the disease. This study explores the early steatosis stage of NAFLD with the aim of identifying molecular mechanisms underlying the etiology of NAFLD. We analyzed liver biopsies and serum samples from patients with high- and low-grade steatosis (also pre-disease states) employing transcriptomics, ELISA-based serum protein analyses and metabolomics. Here, we provide a detailed description of the various related datasets produced in the course of this study. These datasets may help other researchers find new clues for the etiology of NAFLD and the mechanisms underlying its progression to more severe disease states

Clinical parameters of the colorectal cancer patients.

a<p>microsatellite.</p

Differential expression of miRNAs in colon tumor and metastasis tissues.

<p>(<b>A</b>) Top 25 up- and down-regulated miRNAs comparing tumor (left) or metastasis (right) tissues versus normal colon samples as analyzed by Illumina sequencing. All depicted miRNAs sufficed a p-value threshold ≤0.05. A star indicates samples with p≤0.01. (<b>B</b>) Venn diagram of microRNAs expressed in colorectal cancer patients, as determined by Illumina sequencing. (Left) Numbers of detected miRNAs, specific for each tissue (normal (N) = 19, tumor (T) = 34, metastases (M) = 29) and in all tissues (559). (Middle) Venn diagram of the significantly up-regulated miRNAs (p-value ≤0.05) for all comparisons (N/T, N/M and T/M). (Right) Venn diagram of the significantly down-regulated miRNAs (p-value ≤0.05) for all comparisons (N/T, N/M and T/M).</p

Functional assays on miRNA-1 as a potential tumor-suppressor gene.

<p>(<b>A</b>) AlamarBlue cell viability assay to test the effect of miRNA-1. SW480 (primary colon cancer cell line) and SW620 (corresponding metastases cell line) cells were transfected with miRNA-1 mimics (+miR-1) or mock transfected (−miR-1) and measured using an spectrophotometer after 24 h, 48 h and 72 h. The miRNA-1 level was determined by TaqMan assays for mature microRNAs. (<b>B</b>) “Wound healing” assay for miRNA-1 in SW480 and SW620 cells. After 24 h of transfection with miRNA-1 mimics a uniform scratch was generated through each confluent cell layer and “wound” closure was documented after 24 h using a phase-contrast microscope (n = 2). (<b>C</b>) AlamarBlue cell viability assay in SW480 and SW620 cells after camptothecin treatment alone or in combination with miRNA-1. Cell viability was measured after 0 h, 24 h and 48 h of drug treatment using a spectrophotometer.</p