Structural Disorder within Henipavirus Nucleoprotein and Phosphoprotein: From Predictions to Experimental Assessment

Henipaviruses are newly emerged viruses within the Paramyxoviridae family. Their negative-strand RNA genome is packaged by the nucleoprotein (N) within α-helical nucleocapsid that recruits the polymerase complex made of the L protein and the phosphoprotein (P). To date structural data on Henipaviruses are scarce, and their N and P proteins have never been characterized so far. Using both computational and experimental approaches we herein show that Henipaviruses N and P proteins possess large intrinsically disordered regions. By combining several disorder prediction methods, we show that the N-terminal domain of P (PNT) and the C-terminal domain of N (NTAIL) are both mostly disordered, although they contain short order-prone segments. We then report the cloning, the bacterial expression, purification and characterization of Henipavirus PNT and NTAIL domains. By combining gel filtration, dynamic light scattering, circular dichroism and nuclear magnetic resonance, we show that both NTAIL and PNT belong to the premolten globule sub-family within the class of intrinsically disordered proteins. This study is the first reported experimental characterization of Henipavirus P and N proteins. The evidence that their respective N-terminal and C-terminal domains are highly disordered under native conditions is expected to be invaluable for future structural studies by helping to delineate N and P protein domains amenable to crystallization. In addition, following previous hints establishing a relationship between structural disorder and protein interactivity, the present results suggest that Henipavirus PNT and NTAIL domains could be involved in manifold protein-protein interactions

The interaction between the measles virus nucleoprotein and the Interferon Regulator Factor 3 relies on a specific cellular environment

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>The genome of measles virus consists of a non-segmented single-stranded RNA molecule of negative polarity, which is encapsidated by the viral nucleoprotein (N) within a helical nucleocapsid. The N protein possesses an intrinsically disordered C-terminal domain (aa 401–525, N_TAIL) that is exposed at the surface of the viral nucleopcapsid. Thanks to its flexible nature, N_TAILinteracts with several viral and cellular partners. Among these latter, the Interferon Regulator Factor 3 (IRF-3) has been reported to interact with N, with the interaction having been mapped to the regulatory domain of IRF-3 and to N_TAIL. This interaction was described to lead to the phosphorylation-dependent activation of IRF-3, and to the ensuing activation of the pro-immune cytokine RANTES gene.</p> <p>Results</p> <p>After confirming the reciprocal ability of IRF-3 and N to be co-immunoprecipitated in 293T cells, we thoroughly investigated the N_TAIL-IRF-3 interaction using a recombinant, monomeric form of the regulatory domain of IRF-3. Using a large panel of spectroscopic approaches, including circular dichroism, fluorescence spectroscopy, nuclear magnetic resonance and electron paramagnetic resonance spectroscopy, we failed to detect any direct interaction between IRF-3 and either full-length N or N_TAILunder conditions where these latter interact with the C-terminal X domain of the viral phosphoprotein. Furthermore, such interaction was neither detected in <it>E. coli </it>nor in a yeast two hybrid assay.</p> <p>Conclusion</p> <p>Altogether, these data support the requirement for a specific cellular environment, such as that provided by 293T human cells, for the N_TAIL-IRF-3 interaction to occur. This dependence from a specific cellular context likely reflects the requirement for a human or mammalian cellular co-factor.</p

Critical amino acid residues of maurocalcine involved in pharmacology, lipid interaction and cell penetration.

International audienceMaurocalcine (MCa) is a 33-amino acid residue peptide that was initially identified in the Tunisian scorpion Scorpio maurus palmatus. This peptide triggers interest for three main reasons. First, it helps unravelling the mechanistic basis of Ca(2+) mobilization from the sarcoplasmic reticulum because of its sequence homology with a calcium channel domain involved in excitation-contraction coupling. Second, it shows potent pharmacological properties because of its ability to activate the ryanodine receptor. Finally, it is of technological value because of its ability to carry cell-impermeable compounds across the plasma membrane. Herein, we characterized the molecular determinants that underlie the pharmacological and cell-penetrating properties of maurocalcine. We identify several key amino acid residues of the peptide that will help the design of cell-penetrating analogues devoid of pharmacological activity and cell toxicity. Close examination of the determinants underlying cell penetration of maurocalcine reveals that basic amino acid residues are required for an interaction with negatively charged lipids of the plasma membrane. Maurocalcine analogues that penetrate better have also stronger interaction with negatively charged lipids. Conversely, less effective analogues present a diminished ability to interact with these lipids. These findings will also help the design of still more potent cell penetrating analogues of maurocalcine

Toxines animales et canaux ioniques

Les venins animaux contiennent différents types de toxines capables de se fixer de manière spécifique aux différents types de canaux ioniques, qu’ils soient perméables aux ions sodium, calcium, potassium ou chlore. La détermination de la structure tridimensionnelle de ces toxines démontre qu’elles appartiennent à deux familles structurales. Les toxines actives sur les canaux potassium et sodium sont organiséees autour d’un motif structural commun composé d’une hélice α liée à un feuillet β antiparallèle par deux ponts disulfure, alors que les toxines actives sur les canaux calcium possèdent un motif structural appelé “Inhibitory Cystine Knot” dans lequel plusieurs boucles émergent d’un noyau central formé de trois ponts disulfures. L’analyse des variations locales de ces motifs constants nous permet de décrypter les bases structurales de la spécificité des diverses toxines étudiées, et il devient maintenant possible de concevoir de nouvelles molécules dont la spécificité peut être contrôlée. Cette approche est une première étape vers la conception de médicaments actifs dans les maladies impliquant un dysfonctionnement de ces canaux ioniques

Structure par résonance magnétique nucléaire d'effecteurs de canaux ioniques et modélisation de leur interaction

Les canaux ioniques sont à la base du langage électrique des cellules et sont impliqués dans les mécanismes fondamentaux du vivant. L'étude de l'action de toxines extraites de venin d animaux a permis d'identifier les canaux dont les dysfonctionnements mènent à des pathologies aussi graves que les arythmies cardiaques, l'épilepsie, l'hypertension ou le diabète, mais a également mené à la création de nouveaux médicaments pour lutter contre la douleur. Le travail effectué au cours de cette thèse est dirigé par l idée d améliorer encore la connaissance et la compréhension de l interaction des toxines avec les canaux. Au travers de l introduction bibliographique, ce manuscrit présente brièvement les canaux ioniques puis les toxines animales sont décrites suivant le motif structural qu elles adoptent : les deux motifs principaux Csab et ICK, mais également les motifs moins connus tout-a et tout-b. Les résultats obtenus s articulent autour de la détermination de la structure en solution de toxines animales par Résonance Magnétique Nucléaire bidimensionnelle du proton et la détermination de la surface d interaction toxine-canal par arrimage moléculaire sous contraintes. Dans le cas où les structures des deux partenaires ont pu être déterminées, l arrimage moléculaire a permis de prédire de manière fiable et précise les interactions mises en jeu lors de la fixation de la toxine sur le canal. Lorsque la structure du canal n était pas connue, la détermination de la structure et l analyse du moment dipolaire de la toxine ont permis de prédire une surface d interaction putative.Ion channels are the basis of cell communication and are involved in fundamental mechanisms of Life. The study of the pharmacology of animal toxins allows us to identify the channels whose dysfunctions lead to diseases such as cardiac arrhythmias, epilepsy, hypertension or diabetes but also enables to create new drugs against pain. The aim of this thesis was to improve our knowledge of the interaction between toxins and channels. The introduction briefly presents the ion channels and the animal toxins which are described according to the structural scaffold they adopt : the two main scaffolds Csab and ICK and less known scaffolds all-a and all-b. The results are based on the experimental determination of the solution structure of animal toxins by two-dimensional NMR and the determination of toxin-channel interaction surface by distance-constrained molecular docking. When the structures of both partners were available, molecular docking allowed a reliable and accurate prediction of the interactions that occur during the binding. When the structure of the channel was not known, the determination of the structure and the analysis of the dipolar moment of the toxin permitted the prediction of a putative interaction surface.AIX-MARSEILLE2-BU Sci.Luminy (130552106) / SudocSudocFranceF

Etudes structurales par RMN de deux types de molécules (les neurotoxines courtes de scorpions et les anticorps de camélidés)

AIX-MARSEILLE2-BU Sci.Luminy (130552106) / SudocSudocFranceF

Structure par résonance magnétique nucléaire de toxines, effecteurs de canaux ioniques (l anisotropie électrostatique est-elle un facteur déterminant pour leur interaction ?)

Les canaux ioniques sont à la base du langage électrique des cellules et sont impliqués dans les mécanismes fondamentaux du vivant. L'étude de l'action de toxines extraites de venins d animaux a permis d'identifier les canaux dont les dysfonctionnements mènent à des pathologies aussi graves que les arythmies cardiaques, l'épilepsie, l'hypertension ou le diabète mais a également mené à la création de nouveaux médicaments pour lutter contre la douleur. Le travail effectué au cours de cette thèse est dirigé par l idée d améliorer encore la connaissance et la compréhension de l interaction des toxines avec les canaux. Au travers de l introduction bibliographique, ce manuscrit présente brièvement les canaux ioniques puis les toxines animales sont décrites suivant le motif structural qu elles adoptent : les deux motifs principaux Csab et ICK mais également les motifs moins connus tout-a et tout-b. Les résultats obtenus s articulent autour de la détermination de la structure en solution de toxines animales par Résonance Magnétique Nucléaire bidimensionnelle du proton et la détermination de la surface d interaction de ces toxines par analyse de l anisotropie électrostatique. Cette anisotropie électrostatique semble être un facteur déterminant pour l interaction des toxines avec leur site récepteur. Elle permettrait aux toxines de se positionner par rapport au canal ionique de manière à leurs présenter la surface fonctionnelle.The ion channels are the basis of cell communication and are involved in fundamental mechanisms of Life. The study of animal toxins pharmacology allows us to identify the channels whose dysfunctions lead to diseases such as cardiac arrhythmias, epilepsy, hypertension or diabetes but also permits to create new drugs against pain. The aim of the work carried out during this thesis is to improve knowledge and comprehension of the interaction of toxins with the channels. In the introduction, this manuscript briefly presents the ion channels then the animal toxins are described according to the structural scaffold they adopt : two principal scaffolds Csab and ICK but also less known scaffold all-a and all-b. The results obtained are based on the determination of the solution structure of animal toxins by two-dimensional NMR and the determination of interaction surface of these toxins by analysis of the electrostatic anisotropy. This electrostatic anisotropy seems to be a determining factor for the interaction of toxins with their receptor site. It allows the toxins to be correctly positioned in order to present their functional surface to the channelAIX-MARSEILLE1-BU Sci.St Charles (130552104) / SudocSudocFranceF

Un complexe ARN-peptide révèle des mécanismes de co-stabilisation entre ARN et peptide

Une large variété de protéines dont deux protéines du VIH-1 (virus d'immunodéficence humaine de type I) contiennent un domaine riche en arginine, un motif de reconnaissance entre ARN-protein. Ce motif, ne possédant souvent pas de structures tertiaires en absence d'ARN, adopte différentes conformations quand il se fixe sur ce dernier. Notre étude montre que le motif riche en arginine de la protein Tat du virus JDV (virus de la maladie de Jembrana) est capable de reconnaître deux ARNs distincts, l'ARN du VIH-1 et l'ARN du BIV (virus d'immunodeficence bovin), adoptant différentes conformations et utilisant différents acides aminés pour la reconnaissance. De plus, le changement de structure du domaine confère à la proteine Tat de JDV la capacité d'utiliser deux stratégies de fixation, stratégie dépendante ou indépendante de la protéine cycline T1. Nos expériences de mutagénèse montrent que seuls des changements de séquence modérés peuvent être suffisants pour conférer de nouvelles spécificités aux peptides. Nos études structurales du complex JDV Tat-BIV TAR ont permis d'identifier les déterminants responsables de la haute affinité de ce complexe comparée à celle du complexe natif et révèlent de nouveaux mécanismes de co-stabilisation entre peptide et ARN. De plus, deux importants concepts émergent de cette étude: la structure des peptides s'adapte pour contacter l'ARN; réciproquement les peptides et les protéines peuvent moduler la conformation de l'ARN.AIX-MARSEILLE3-BU Sc.St Jérô (130552102) / SudocSudocFranceF

Using synthetic antibodies to explore the basic principles of molecular recognition

Antibodies are one of the major molecules responsible for immune recognition in vertebrates. Antibodies are evolved somatically from a naïve repertoire of a few million unique members, and diversity is concentrated in the complementarity determining regions that form the antigen-binding site. Antigen-binding sites are enriched for tyrosine, serine and glycine residues in vertebrate repertoires, and we investigated whether this bias reflects chemical properties of these residue types which make them particularly favorable for antigen recognition. We generated synthetic antibody libraries with chemical diversity restricted to small subsets of amino acids and assessed the capacity for antigen recognition. We found that combinations of four amino acids (tyrosine, alanine, aspartate and serine) were sufficient for the generation of antibodies with high affinity and specificity. Structural and mutagenic characterization of antibodies binding specifically to vascular endothelial growth factor revealed that tyrosine dominates the structural and functional paratopes. The results support a model for naïve antigen recognition in which large tyrosine side chains establish binding contacts with antigen, and small Ser and Ala side chains serve as auxiliaries that help to position tyrosine in favorable binding conformations. This model has been further validated by the selection of specific antibodies from a binary diversity composed of only tyrosine and serine. Taken together, the results show that the chemical nature of tyrosine endows the amino acid with a privileged role in antigen recognition, and this likely explains the high abundance of Tyr in natural antigen-binding sites.Les anticorps sont au centre de la reconnaissance immunitaire chez les vertébrés. Ils sont engendrés à partir d'un répertoire naïf de plusieurs millions de séquences uniques. Malgré une grande diversité le site de fixation de l'antigène est naturellement riche en résidus tyrosine, sérine et glycine. Nous avons étudié si cette préférence reflète des propriétés chimiques particulières pour ces types de résidu qui les rendraient propices à la reconnaissance antigénique. Nous avons évalué la fonctionnalité de banques synthétiques d'anticorps avec une diversité chimique limitée à des sous-groupes d'acides aminés. Une combinaison de quatre acides aminés (tyrosine, alanine, aspartate et sérine) s'est avérée être suffisante pour la génération d'anticorps à haute affinité et spécificité. La caractérisation d'anticorps qui se lient spécifiquement au facteur de croissance de l'endothélium vasculaire indique que les résidus tyrosine dominent les paratopes structuraux et fonctionnels. Les résultats confortent un modèle de reconnaissance naïve d'antigène dans lequel les larges chaînes latérales des résidus tyrosine établiraient des contacts de liaison avec l'antigène et les résidus sérine et alanine aideraient au positionnement des tyrosine dans des conformations favorables pour la liaison. Ce modèle a été corroboré par la sélection d'anticorps spécifiques à partir d'une diversité binaire composée uniquement de tyrosine et de sérine. Globalement, les résultats montrent que la nature chimique du résidu tyrosine le dote d'un rôle privilégié dans la reconnaissance antigénique, expliquant probablement l'abondance élevée de tyrosine dans les sites naturels de fixation de l'antigène.AIX-MARSEILLE1-BU Sci.St Charles (130552104) / SudocSudocFranceF