Efeitos da ovariectomia e da reposição hormonal sobre a hidrólise de nucleotídeos da adenina em soro e plaquetas de ratas

Os hormônios esteróides sexuais são amplamente conhecidos pelo seu envolvimento em numerosas respostas fisiológicas. Após a menopausa, quando diminuem os níveis de estrogênio circulantes, as mulheres apresentam um risco aumentado de doenças cardíacas. Evidências têm sugerido que no sistema cardiovascular, o estrogênio exerce um papel protetor reduzindo o risco de desenvolvimento de aterosclerose e complicações cardiovasculares, através da modulação da função vascular e da imbição da agregação plaquetária Os processos de hemostasia e formação de trombos também podem ser afetados pelos nucleotídeos da adenina e pelo nucleosídeo adenosina. Extracelularmente, o nucleotídeo ADP é reconhecido como maior agonista plaquetário, enquanto o nucleosídeo adenosina é um potente vasodilatador e imbidor da agregação plaquetária. Conseqüentemente, a regulação das enzimas que controlam os níveis destes nucleotídeos e de adenosina na circulação torna-se essencial na modulação dos processos de agregação plaquetária, vasodilatação e fluxo coronariano. Resultados recentes demonstram que as atividades de algumas enzimas podem ser moduladas por variações dos níveis de estrogênio, assim, no presente estudo resolvemos investigar os efeitos da ausência dos hormônios ovarianos (ovariectomia) e da terapia de reposição de estradiol sobre a atividade das enzimas que degradam ATP, ADP e AMP em soro e plaquetas de ratas. A privação hormonal imbiu significativamente a hidrólise de ATP, ADP e AMP em plaquetas; no soro a hidrólise dos três nucleotídeos foi significativamente aumentada, enquanto que a hidrólise do substrato artificial marcador da enzima fosfodiesterase não foi alterada neste tratamento. Contrariamente, a reposição de estradiol diminuiu significativamente a hidrólise dos três nucleotídeos e do substrato artificial no soro em comparação aos respectivos controles; nas plaquetas, o tratamento não reverteu a imbição causada pela ausência hormonal. Além disso, testamos os hormônios 17β-estradiol, sulfato de diidroepiandrosterona e pregnenolona in vitro no soro dos animais para verificar uma possível ação direta destes hormônios sobre as enzimas testadas, porém não foram observadas alterações na hidrólise dos nucleotídeos. Nossos resultados sugerem um forte envolvimento do sistema hormonal com as enzimas que controlam os níveis de nucleotídeos na circulação. Os resultados em plaquetas indicam que a privação hormonal afeta a hidrólise de ATP, ADP e AMP e conseqüentemente os níveis destes nucleotídeos na circulação. Sendo o ADP um potente ativador da agregação plaquetária e a adenosina formada através da sua hidrólise até AMP, um potente imbidor, o resultado encontrado em plaquetas pode contnbuir para uma melhor compreensão das complicações cardiovasculares descritas na menopausa. Por outro lado, o aumento da hidrólise dos nucleotídeos encontrado no soro pode estar representando um mecanismo compensatório para a manutenção dos nucleotídeos extracelulares, na tentativa de controlar os eventos desencadeados pela privação hormonal no sangue total

Caracterização parcial da hidrólise de ATP, ADP e AMP em fração microssomal cardíaca de ratos adultos

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Caracterização parcial da hidrólise de ATP, ADP e AMP em fração microssomal cardíaca de ratos adultos

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Aquatic exercise associated or not with grape juice consumption-modulated oxidative parameters in Parkinson disease patients : a randomized intervention study

Parkinson's disease (PD) is a neurodegenerative disorder with significant motor disabilities and cognitive decline. Importantly, the imbalance of oxidative stress is related to PD physiopathology and progression. This study aimed to evaluate the impact of grape juice consumption associated with an aquatic exercise protocol on oxidative stress parameters and cognitive function in individuals with PD. The participants were randomized into two groups: grape juice group (GJG) and control group (CG) and were submitted to 4 weeks of an aquatic intervention (twice a week, approximately 60 minutes/session). The GJG also consumed 400 ml of grape juice per day (integral and conventional) during this period. Cognitive function was assessed by the Montreal Cognitive Assessment (MoCa) questionnaire. For the analysis of oxidative stress markers, specifically lipid oxidative damage (TBARS), proteins (Carbonil), acid uric and the activity of antioxidant enzymes (superoxide dismutase, glutathione peroxidase and catalase), blood collection were done before and after intervention. No changes were observed in cognitive function after intervention in both groups. Regarding biomarkers, a reduction of antioxidant enzymes, thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and uric acid was observed in both groups. However, only the GJG showed a significant reduction on protein oxidation levels after intervention. In conclusion, the consumption of grape juice associated with an aquatic exercise protocol might be consider an effective alternative to reduce the oxidative damage in PD, reinforcing the importance of this intervention in promoting beneficial impact in this population

Identificação bioquímica e molecular de nucleotidases em fração solúvel e microssomal de tecido cardíaco de ratos

Os nucleotídeos da adenina (ATP, ADP e AMP) e o nucleosídeo adenosina são importantes moléculas sinalizadoras que estão envolvidas nos mecanismos de crescimento e diferenciação celular, angiogênese, fluxo sanguíneo, condução e taxa cardíaca, e sensibilidade à estimulação adrenérgica no coração. Paralelamente a esses efeitos extracelulares, algumas evidências com fibras musculares permeabilizadas e vesículas de retículo sarcoplasmático cardíaco (chamados de microssomas) têm sugerido que estas purinas poderiam modular correntes de Ca²+ do retículo sarcoplasmático, ativando diretamente o canal iônico. Mudanças nos níveis de ATP, ADP, AMP e adenosina alteram suas ações, o que tem sido implicado em diversos processos patofisiológicos do coração. Consequentemente, as enzimas que metabolizam nucleotídeos, denominadas ectonucleotidases, que fazem parte da sinalização purinérgica, desempenham um componente modulatório essencial, pois controlam a quantidade e a taxa de degradação dos nucleotídeos além da formação do respectivo nucleosídeo. No presente estudo, foi analisada a presença dos membros das famílias das E-NTPDases, E-NPPs e ecto-5'-nucleotidase em frações solúvel e microssomal cardíacas de ratos. No estudo das E-NTPDases, a caracterização bioquímica das atividades de hidrólise de ATP e ADP em condições de inibição da atividade da ATPase mitocondrial e da adenilato cinase, revelou enzimas dependentes de cátions divalentes que apresentam pH ótimo de 8,0 na fração solúvel e 7,5 na fração microssomal. Os valores de KM aparente calculados a partir do plot de Eadie-Hofstee na fração solúvel foram 131,2 e 57,1 µM e de Vmax 71,3 e 9,3 nmol Pi/ min /mg de proteína para a hidrólise de ATP e ADP, respectivamente. Na fração microsomal, os valores de KM calculados para ATP e ADP foram 315,2 e 131 µM, e os valores de Vmax foram 1180,6 and 100,4 nmol Pi/ min/ mg de proteína, respectivamente. Considerando a atividade da ecto-5'-nucleotidase, utilizando AMP como substrato, os resultados mostraram que o cation e a concentração requerida para a atividade máxima nas duas frações, foi magnésio na concentração final de 1 mM. O pH ótimo para ambas frações foi 9,5. Os valores de KM foram 59,7 µM e 134,8 µM com um valor de Vmax calculado de 6,7 e 143,8 nmol Pi/ min/ mg de proteína para fração solúvel e microsomal, respectivamente. A análise de Western blotting para a ecto-5'-nucleotidase revelou uma proteína de 70kDa nas duas frações e uma maior densidade na fração microssomal. Usando p-nitrofenil-5'-timidina monofosfato (p-Nph-5'-TMP) como substrato para as E-NPPs, nós observamos um pH ótimo alcalino e dependência para cations divalentes. Os valores de KM corresponderam a 118,5 e 91,9 µM e os valores do Vmax calculado foram 2,5 e 113,8 nmol p-nitrofenol/ min/ mg de proteína para a fração solúvel e microsomal, respectivamente. A presença dessas enzimas no coração tem, provavelmente, uma função fisiológica na geração de adenosina. Além disso, na fração microsomal, essas enzimas poderiam exercer um papel na modulação do processo de excitação-contração do coração através do envolvimento com o influxo de Ca²+ para o retículo sarcoplasmático. Com o intuito de investigar os possíveis efeitos da cafeína sobre a atividade das ectonucleotidases na fração solúvel e microssomal cardíaca, nós utilizamos a administração aguda e crônica de cafeína. Para o estudo agudo, nós administramos a cafeína por oral gavage em uma única dose de 5, 15 ou 45 mg/Kg. Os controles receberam salina e todos os animais foram mortos 1,5h após a gavage. No tratamento crônico, a cafeína (0,3 or 1,0 mg/mL) foi oralmente administrada por 14 dias na água e os animais foram mortos no 15º dia. Os resultados preliminares mostram que tanto o tratamento agudo quanto o crônico foram capazes de alterar diferentemente a hidrólise dos nucleotídeos em ambas frações. Todavia, mais dados são necessários para tentar relacionar os resultados encontrados e os conhecidos efeitos da cafeína no coração.Adenine nucleotides (ATP, ADP, and AMP) and the nucleoside adenosine are important signaling molecules that are very much involved in the mechanisms of cell growth and differentiation, angiogenesis, coronary blood flow, cardiac conduction and heart rate, and sensitivity to adrenergic stimulation in the heart. Besides these extracellular effects, some evidences with permeabilized muscle fibers and cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles (called microsomes) have suggested that these purines could modulate Ca²+ currents of the sarcoplasmic reticulum activating directly the ionic channel. Changes in the adenine nucleotides and adenosine levels alter their actions and have been implicated in diverse patho-physiological processes of the heart. Consequently, nucleotide-metabolizing enzymes (ectonucleotidases) play an essential modulatory component of the purine signaling once that controls the rate, amount and timing of nucleotide degradation and ultimately, the nucleoside formation. In the present study, we have analyzed the presence of the E-NTPDase family members, E-NPPs and ecto-5'-nucleotidase in rat cardiac soluble and microsomal fractions. In the E-NTPDase study, biochemical characterization of ATPase and ADPase activities, under conditions where mitochondrial ATPase and adenylate kinase activities were blocked, demonstrates divalent-cation dependent enzymes that presented optimum pH of 8.0 to soluble, and 7.5 to microsomal fraction. The apparent KM values calculated from the Eadie-Hofstee plot for ATP and ADP in soluble fraction were 131.2 and 57.1 µM, respectively. Vmax values calculated were 71.3 and 9.3 nmol Pi/ min/ mg of protein for ATP and ADP hydrolysis, respectively. In microsomal fraction, the KM values calculated for ATP and ADP were 315.2 and 131 µM, respectively. Vmax values in this fraction were 1180.6 and 100.4 nmol Pi/ min/ mg of protein when using ATP and ADP as substrates, respectively. Considering ecto-5’-nucleotidase activity with AMP as substrate, the results showed that the cation and the concentration required for maximal activity in the two fractions was magnesium in the final concentration of 1.0 mM. The pH optimum for both fractions was 9.5. The apparent KM calculated were 59.7 µM and 134.8 µM with a Vmax values calculated of 6.7 and 143.8 nmol Pi/ min/ mg of protein from soluble and microsomal fractions, respectively. Western blotting analysis to ecto-5'-nucleotidase revealed a 70kDa protein in both fractions and a major density in the microsomal fraction. Using p-nitrophenyl-5'-thymidine monophosphate (p-Nph-5'-TMP) as substrate for E-NPPs, we observed an alkaline optimum pH and divalent cation dependence. he KM value corresponded to 118.5 and 91.9 µM and Vmax value calculated were 2.5 and 113.8 nmol p-nitrophenol/ min/ mg of protein from soluble and microsomal fractions, respectively The presence of these enzymes in the heart probably has a physiological function in the generation of signaling adenosine. Furthermore, in the microsomal fraction, they could have a role in the modulation of the excitation-contraction coupling process throughout the involvement with the Ca²+ influx to sarcoplasmic reticulum. To investigate the possible effects of caffeine on ectonucleotidase activity in cardiac soluble and microsomal fractions of rats, we used acute and chronic caffeine administration. For the acute study, we administrate to the rats by gavage, a single oral dose of 5, 15 or 45 mg/Kg b.w. of caffeine. Controls received saline and all animals were euthanized 1.5h after gavage. In the chronic treatment, caffeine (0.3 or 1.0 mg/mL) was orally administered for 14 days in the drinking water and the animals were euthanized on the day 15. Preliminary results showed that acute and chronic caffeine treatment were capable of differently alter nucleotide hydrolysis in both fractions. However, more data are necessary to correlate the results founded and the known cardiac effects of caffeine

Identificação bioquímica e molecular de nucleotidases em fração solúvel e microssomal de tecido cardíaco de ratos

Os nucleotídeos da adenina (ATP, ADP e AMP) e o nucleosídeo adenosina são importantes moléculas sinalizadoras que estão envolvidas nos mecanismos de crescimento e diferenciação celular, angiogênese, fluxo sanguíneo, condução e taxa cardíaca, e sensibilidade à estimulação adrenérgica no coração. Paralelamente a esses efeitos extracelulares, algumas evidências com fibras musculares permeabilizadas e vesículas de retículo sarcoplasmático cardíaco (chamados de microssomas) têm sugerido que estas purinas poderiam modular correntes de Ca²+ do retículo sarcoplasmático, ativando diretamente o canal iônico. Mudanças nos níveis de ATP, ADP, AMP e adenosina alteram suas ações, o que tem sido implicado em diversos processos patofisiológicos do coração. Consequentemente, as enzimas que metabolizam nucleotídeos, denominadas ectonucleotidases, que fazem parte da sinalização purinérgica, desempenham um componente modulatório essencial, pois controlam a quantidade e a taxa de degradação dos nucleotídeos além da formação do respectivo nucleosídeo. No presente estudo, foi analisada a presença dos membros das famílias das E-NTPDases, E-NPPs e ecto-5'-nucleotidase em frações solúvel e microssomal cardíacas de ratos. No estudo das E-NTPDases, a caracterização bioquímica das atividades de hidrólise de ATP e ADP em condições de inibição da atividade da ATPase mitocondrial e da adenilato cinase, revelou enzimas dependentes de cátions divalentes que apresentam pH ótimo de 8,0 na fração solúvel e 7,5 na fração microssomal. Os valores de KM aparente calculados a partir do plot de Eadie-Hofstee na fração solúvel foram 131,2 e 57,1 µM e de Vmax 71,3 e 9,3 nmol Pi/ min /mg de proteína para a hidrólise de ATP e ADP, respectivamente. Na fração microsomal, os valores de KM calculados para ATP e ADP foram 315,2 e 131 µM, e os valores de Vmax foram 1180,6 and 100,4 nmol Pi/ min/ mg de proteína, respectivamente. Considerando a atividade da ecto-5'-nucleotidase, utilizando AMP como substrato, os resultados mostraram que o cation e a concentração requerida para a atividade máxima nas duas frações, foi magnésio na concentração final de 1 mM. O pH ótimo para ambas frações foi 9,5. Os valores de KM foram 59,7 µM e 134,8 µM com um valor de Vmax calculado de 6,7 e 143,8 nmol Pi/ min/ mg de proteína para fração solúvel e microsomal, respectivamente. A análise de Western blotting para a ecto-5'-nucleotidase revelou uma proteína de 70kDa nas duas frações e uma maior densidade na fração microssomal. Usando p-nitrofenil-5'-timidina monofosfato (p-Nph-5'-TMP) como substrato para as E-NPPs, nós observamos um pH ótimo alcalino e dependência para cations divalentes. Os valores de KM corresponderam a 118,5 e 91,9 µM e os valores do Vmax calculado foram 2,5 e 113,8 nmol p-nitrofenol/ min/ mg de proteína para a fração solúvel e microsomal, respectivamente. A presença dessas enzimas no coração tem, provavelmente, uma função fisiológica na geração de adenosina. Além disso, na fração microsomal, essas enzimas poderiam exercer um papel na modulação do processo de excitação-contração do coração através do envolvimento com o influxo de Ca²+ para o retículo sarcoplasmático. Com o intuito de investigar os possíveis efeitos da cafeína sobre a atividade das ectonucleotidases na fração solúvel e microssomal cardíaca, nós utilizamos a administração aguda e crônica de cafeína. Para o estudo agudo, nós administramos a cafeína por oral gavage em uma única dose de 5, 15 ou 45 mg/Kg. Os controles receberam salina e todos os animais foram mortos 1,5h após a gavage. No tratamento crônico, a cafeína (0,3 or 1,0 mg/mL) foi oralmente administrada por 14 dias na água e os animais foram mortos no 15º dia. Os resultados preliminares mostram que tanto o tratamento agudo quanto o crônico foram capazes de alterar diferentemente a hidrólise dos nucleotídeos em ambas frações. Todavia, mais dados são necessários para tentar relacionar os resultados encontrados e os conhecidos efeitos da cafeína no coração.Adenine nucleotides (ATP, ADP, and AMP) and the nucleoside adenosine are important signaling molecules that are very much involved in the mechanisms of cell growth and differentiation, angiogenesis, coronary blood flow, cardiac conduction and heart rate, and sensitivity to adrenergic stimulation in the heart. Besides these extracellular effects, some evidences with permeabilized muscle fibers and cardiac sarcoplasmic reticulum vesicles (called microsomes) have suggested that these purines could modulate Ca²+ currents of the sarcoplasmic reticulum activating directly the ionic channel. Changes in the adenine nucleotides and adenosine levels alter their actions and have been implicated in diverse patho-physiological processes of the heart. Consequently, nucleotide-metabolizing enzymes (ectonucleotidases) play an essential modulatory component of the purine signaling once that controls the rate, amount and timing of nucleotide degradation and ultimately, the nucleoside formation. In the present study, we have analyzed the presence of the E-NTPDase family members, E-NPPs and ecto-5'-nucleotidase in rat cardiac soluble and microsomal fractions. In the E-NTPDase study, biochemical characterization of ATPase and ADPase activities, under conditions where mitochondrial ATPase and adenylate kinase activities were blocked, demonstrates divalent-cation dependent enzymes that presented optimum pH of 8.0 to soluble, and 7.5 to microsomal fraction. The apparent KM values calculated from the Eadie-Hofstee plot for ATP and ADP in soluble fraction were 131.2 and 57.1 µM, respectively. Vmax values calculated were 71.3 and 9.3 nmol Pi/ min/ mg of protein for ATP and ADP hydrolysis, respectively. In microsomal fraction, the KM values calculated for ATP and ADP were 315.2 and 131 µM, respectively. Vmax values in this fraction were 1180.6 and 100.4 nmol Pi/ min/ mg of protein when using ATP and ADP as substrates, respectively. Considering ecto-5’-nucleotidase activity with AMP as substrate, the results showed that the cation and the concentration required for maximal activity in the two fractions was magnesium in the final concentration of 1.0 mM. The pH optimum for both fractions was 9.5. The apparent KM calculated were 59.7 µM and 134.8 µM with a Vmax values calculated of 6.7 and 143.8 nmol Pi/ min/ mg of protein from soluble and microsomal fractions, respectively. Western blotting analysis to ecto-5'-nucleotidase revealed a 70kDa protein in both fractions and a major density in the microsomal fraction. Using p-nitrophenyl-5'-thymidine monophosphate (p-Nph-5'-TMP) as substrate for E-NPPs, we observed an alkaline optimum pH and divalent cation dependence. he KM value corresponded to 118.5 and 91.9 µM and Vmax value calculated were 2.5 and 113.8 nmol p-nitrophenol/ min/ mg of protein from soluble and microsomal fractions, respectively The presence of these enzymes in the heart probably has a physiological function in the generation of signaling adenosine. Furthermore, in the microsomal fraction, they could have a role in the modulation of the excitation-contraction coupling process throughout the involvement with the Ca²+ influx to sarcoplasmic reticulum. To investigate the possible effects of caffeine on ectonucleotidase activity in cardiac soluble and microsomal fractions of rats, we used acute and chronic caffeine administration. For the acute study, we administrate to the rats by gavage, a single oral dose of 5, 15 or 45 mg/Kg b.w. of caffeine. Controls received saline and all animals were euthanized 1.5h after gavage. In the chronic treatment, caffeine (0.3 or 1.0 mg/mL) was orally administered for 14 days in the drinking water and the animals were euthanized on the day 15. Preliminary results showed that acute and chronic caffeine treatment were capable of differently alter nucleotide hydrolysis in both fractions. However, more data are necessary to correlate the results founded and the known cardiac effects of caffeine